人嗜酸粒細胞親合素（Eotaxin）系列N端突變體及其原核表達載體的構建及表達.pdf

1、背景： 嗜酸粒細胞在變應性炎癥局部募集和活化、以及嗜酸粒細胞釋放的炎癥介質的作用導致了變應性鼻炎發(fā)生。嗜酸粒細胞在炎癥局部的募集是由趨化因子介導。Eotaxin是作用最強的嗜酸粒細胞趨化因子，其通過與表達于嗜酸粒細胞表面的惟一受體CCR3結合而發(fā)揮生物學作用。研究已表明采用抗CCR3抗體等阻斷CCR3-Eotaxin軸的作用可緩解變應性疾病。對野生型-Eotaxin結構和功能相關性的研究顯示。EotaxinN氨基末端在其與受體結

2、合后的信號傳導中起重要作用。突變其N氨基末端將極大地改變Eotaxin的生物學活性，并可望獲得具有與CCR3結合能力而不能引起相應信號傳導的CCR3拮抗劑。理論上，由于CCR3是Eotaxin的惟一受體，Eotaxin突變體拮抗CCR3的作用強、特異性高。 目的： 本實驗擬通過基因操作技術，獲得人嗜酸粒細胞親合素Eotaxin基因，構建系列的EotaxinN端突變體及其原核表達載體，為進一步純化和檢測其生物學活性，篩選C

3、CR3拮抗劑做準備。 方法： 1、從脾臟提取總RNA，經RT-PCR擴增編碼人Eotaxin全長cDNA序列，然后將目的片段克隆至T載體(pTZ57R)，得到重組質粒PT-Eotaxin，重組質粒用Eotaxin特異性引物進行PCR鑒定，并用內切酶KpnI，XhoI進行雙酶切鑒定，最后送上海博亞生物技術有限公司進行序列分析。 2、根據(jù)PT-Eotaxin的序列，使用突變引物設計軟件，針對Eotaxin成熟鏈N末端

4、設計8對特異性點突變引物，用點突變的方法，在PT-Eotaxin的基礎上用Met替代(單個)EotaxinN-端肽氨基酸殘基，突變PCR產物轉入大腸桿菌XL1-Blue后用氨芐青霉素篩選，獲得突變體重組子(Met-Eotaxins)，選取陽性克隆進行序列分析。 3、根據(jù)突變體重組子-Met-Eotaxins成熟鏈部分序列，自行設計5對特異性引物，擴增野生型及各突變體的成熟鏈片段，使用定向克隆技術將目的片段克隆到原核表達載體pET

5、30a(+)上，重組子用卡那霉素進行篩選，陽性克隆提取質粒后用T7引物做PCR鑒定，內切酶KpnI，XhoI進行雙酶切鑒定，最后進行序列測定，獲得重組表達質粒(pET30a(+)-Eotaxin，pET30a(+)-Met-Eotaxins)。 4、將鑒定正確的9個重組質粒分別轉化表達型宿主菌E.coliBL21(DE3)，經篩選后即得特異性表達Eotaxin和Met-Eotaxins成熟鏈融合蛋白的工程菌。將單克隆工程菌接種到

6、50ml含有卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃搖菌培養(yǎng)到對數(shù)中期(OD600=0.5～1.0)，加入IPTG繼續(xù)誘導培養(yǎng)1～6h，收集菌體。對誘導產物分別進行SDS-PAGE和Western-Blot分析。 結果： 1.重組質粒PT-Eotaxin，用Eotaxin特異性引物進行PCR鑒定，以及用內切酶KpnI，XhoI進行雙酶切鑒定，PCR護增片段與酶切片段實際大小均與理論大小一致；序列分析結果與.genbank對照，完全

7、符合。 2.突變體重組子(Met-Eotaxins)序列分析結果經對照發(fā)現(xiàn)，我們得到的突變體與設計完全一致。 3.重組表達質粒(pET30a(+)-Eotaxin，pET30a(+)-Met-Eotaxins)用特異性引物(T7)進行PCR鑒定，以及用內切酶KpnI，XhoI進行雙酶切鑒定，PCR擴增片段與酶切片段實際大小均與理論大小一致，序列分析結果表明，各重組表達質粒中，Eotaxin與Met-Eotaxins的核苷

8、酸序列完全正確，讀碼框無移位。 4.重組表達質粒誘導產物SDS-PAGE分析結果表明，各重組表達質粒誘導表達產物中均有相應的融合蛋白表達，而且各重組融合蛋白表達水平較高，表達量可達總蛋白量的32～35.5％。進一步Western-Blot分析表明，各融合蛋白均能和特異性Eotaxin一抗結合，證實所表達的確系目的蛋白。 結論： 本實驗成功克隆了Eotaxin基因，成功的構建了一系列EotaxinN末端的突變體重組