重組人FL在大腸桿菌中的高效表達和生物學(xué)活性的鑒定.pdf

1、本實驗選取對FL基因進行改造后的合成基因，在大腸桿菌體系中高效地表達了FL功能片段，通過對包涵體變性和復(fù)性，應(yīng)用HiTrapTM柱一步純化獲得了較高純度的rhFL134重組蛋白。并用經(jīng)典的集落形成實驗和CD34+細胞的擴增實驗證實了rhFL134重組蛋白具有顯著的生物學(xué)活性。本實驗為具有生物學(xué)活性的rhFL的大規(guī)模生產(chǎn)提供了有效的方案，為FL的進一步研究和應(yīng)用奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。一、fl134表達載體的構(gòu)建　　以本實驗室的合成FL胞外段基

2、因和天然的fl基因為模板，應(yīng)用PCR技術(shù)擴增出對FL蛋白生物學(xué)活性至關(guān)重要的前134個氨基酸的基因序列(fl134)，克隆入pET30a表達載體，并且在FL的N端引入了一個Met和C端加了Leu和Glu各一個pET30a表達載體，并且在FL的N端引入了一個Met和C端加了Leu和Glu各一個及6個His，進而轉(zhuǎn)入表達菌株BL21中?！?二、FL134重組蛋白的表達純化只有FL合成基因能在大腸桿菌體系中表達，而天然基因在此體系中得不到

3、表達。 三、rhFL134重組蛋白的生物學(xué)鑒定1、重組rhFL134蛋白對小鼠骨髓混合集落形成的促進作用聯(lián)合mGM-CSF(20μg/L)和mIL-3(1ml/LWEHI培養(yǎng)上清)，在重組蛋白rhFL134對小鼠骨髓細胞的混合集落(CFU-mix)形成實驗中，發(fā)現(xiàn)重組蛋白rhFL134與陰性對照相比有顯著的促集落形成的作用，與商品化的rhFL的作用相似，其效應(yīng)在一定范圍內(nèi)呈劑量相關(guān)性。2、重組人rhFL134蛋白對人臍帶血中CD