白蛋白對大鼠腎臟功能及整合素連接激酶、整合素β1和α-輔肌動蛋白-4的影響.pdf

1、研究背景:
　　 腎臟是人體的重要器官，主要參與機體的排泄以及維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。慢性腎病已經(jīng)成為當(dāng)今社會嚴重危害人類健康的疾病之一。蛋白尿是慢性腎病進展的獨立危險因素，病人一旦出現(xiàn)持續(xù)性蛋白尿則病情不可逆轉(zhuǎn)而發(fā)展至終末期腎功能衰竭。腎小球是腎臟發(fā)揮濾過和排泄功能的主要部位，在某些病理因素的作用下，腎小球的濾過屏障極易受損，導(dǎo)致大分子蛋白質(zhì)隨尿液滲出而形成蛋白尿。腎小球的濾過屏障由毛細血管內(nèi)皮細胞、基底膜以及足細胞構(gòu)成，足細胞在腎

2、小球濾過過程中發(fā)揮了最關(guān)鍵的作用。腎小球疾病主要的病理學(xué)改變?yōu)槟I小球濾過屏障受損而導(dǎo)致的蛋白尿。研究認為尿蛋白對近端腎小管上皮細胞有直接損害作用，蛋白尿可以通過損傷腎小管來加重腎臟損害和促進慢性腎病的進展。以往的研究表明，足細胞數(shù)目及其密度與尿蛋白量呈顯著負相關(guān)，腎病患者臨床表現(xiàn)為蛋白尿時均伴有足細胞數(shù)目及密度的減少，其中以大量蛋白尿最為顯著，但其機制尚未清楚。
　　 Integrinα3β1是足細胞貼近GBM側(cè)的跨膜蛋白，在維

3、持足細胞與GBM之間的粘附和足細胞內(nèi)外跨膜信號傳導(dǎo)方面發(fā)揮了重要作用。Integrinα3β1不僅可以通過與GBM上的配體直接結(jié)合，將足細胞牢牢地錨定在基底膜上;還可以通過與細胞骨架直接連接維持足突的形態(tài)，調(diào)節(jié)細胞骨架的動力學(xué)。一方面，ILK通過C端與integrinβ1相連，直接參與和調(diào)節(jié)整合素通路的相關(guān)過程;另一方面，ILK還可以通過N端與α-actinin-4及細胞骨架相連，參與整合素和α-actinin-4介導(dǎo)的細胞骨架動力學(xué)過

4、程。α-Actinin-4是足細胞上特異表達的細胞骨架輔肌動蛋白，能夠與F-actin直接連接，在維持足突結(jié)構(gòu)方面尤為重要。白蛋白是蛋白尿的主要成分，因此，本實驗選取ILK、integrinβ1和α-actinin-4作為目的蛋白，研究白蛋白超負荷大鼠腎臟功能的改變及腎臟總ILK、integrinβ1和α-actinin-4的表達情況。此外，我們通過體外足細胞白蛋白超負荷模型觀測在大量白蛋白的刺激下足細胞中ILK、integrinβ1和

5、α-actinin-4的表達情況。為深入探討足細胞的損傷機制提供理論依據(jù)，對慢性腎病的早期防治具有重要意義。
　　 實驗方法:
　　 一、白蛋白對大鼠腎臟功能及ILK、integrinβ1和α-actinin-4的影響
　　 模型組大鼠每天每只腹腔注射2g白蛋白，對照組大鼠每天每只腹腔注射等體積生理鹽水。收集白蛋白注射后第1、3、7、13天的尿液，第14天處死大鼠，取腎臟和血液用于后續(xù)試驗。
　　 1.白

6、蛋白對大鼠腎臟功能的影響。
　　 記錄大鼠體重和尿量，測定尿總蛋白和尿肌酐;取左腎組織進行常規(guī)石蠟切片，HE染色，觀察腎臟組織形態(tài);透射電鏡觀察足細胞形態(tài);取血測定血肌酐、稱量右腎重量。
　　 2.白蛋白對大鼠腎臟總ILK、integrinβ1和α-actinin-4的影響
　　 采用westernblot和免疫組織化學(xué)染色法觀察白蛋白對大鼠腎總ILK、integrinβ1和α-actinin-4蛋白表達的影響;

7、采用RT-PCR法觀察白蛋白對大鼠腎總ILK、integrinβ1和α-actinin-4mRNA表達的影響。
　　 二、白蛋白對足細胞ILK、integrinβ1和α-actinin-4的影響
　　 實驗前將分化成熟的足細胞(MP5)在1％FCS中過夜，以BSA的終濃度0、5、10、20mg/mL孵育12、24、48h。Westernblot和免疫熒光法檢測白蛋白對足細胞ILK、integrinβ1和α-actinin

8、-4蛋白表達的影響;實時定量PCR法檢測白蛋白對足細胞ILK、integrinβ1和α-actinin-4mRNA表達的影響。
　　 實驗結(jié)果:
　　 一、白蛋白對大鼠腎臟功能及ILK、integrinβ1和α-actinin-4的影響
　　 1.白蛋白對大鼠腎臟功能的影響。
　　 白蛋白注射第3天24h尿總蛋白急劇升高并達到最高峰，第7天至第13天均維持著較高的水平;白蛋白組尿量低于對照組且呈深黃色;H

9、E染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)白蛋白注射組腎小球內(nèi)有細胞融合發(fā)生，腎小管管腔上皮細胞破損;電鏡照片顯示白蛋白注射組足突發(fā)生明顯融合，有部分GBM裸露。
　　 2.白蛋白對大鼠腎臟總ILK、integrinβ1和α-actinin-4的影響
　　 Westernblot和免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明白蛋白組大鼠腎總ILK和α-actinin-4蛋白的表達水平高于對照組，而integrinβ1蛋白的表達水平低于對照組;RT-PCR結(jié)果表明白蛋白

10、組大鼠腎總ILK和α-actinin-4mRNA的表達水平高于對照組，而白蛋白組大鼠腎總integrinβ1mRNA的表達水平低于對照組。
　　 二、白蛋白對小鼠足細胞ILK、integrinβ1和α-actinin-4的影響
　　 足細胞與白蛋白作用一段時間后，ILK與α-actinin-4的蛋白水平和mRNA水平顯著升高，并且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性和時間依賴性。Integrinβ1的蛋白表達呈一定濃度依賴性和時間依賴性