TLR4及其相關信號通路在自身免疫性糖尿病中的作用機制探討與藥物干預.pdf

1、第一部分：TLR4信號通路對NOD小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)病的影響
　　實驗背景：
　　目前臨床上尚無自身免疫性糖尿病(Autoimmune diabetes),又稱1型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus,T1DM)的有效治療手段。傳統(tǒng)觀點認為,感染是T1DM發(fā)病的誘因之一。但近年來,基于衛(wèi)生假說的提出,動物和臨床研究均顯示,適當?shù)母腥緦Π═1DM在內的自身免疫性疾病發(fā)病具有抑制作用,其具體機制尚不清楚

2、。而作為來源于革蘭氏陰性菌脂多糖(Lipopolysaccharid,LPS)的受體,Toll-like receptor(TLR)4在T1DM中的作用引起了人們的關注。我們設想,LPS對TLR4信號通路的調節(jié)作用可能參與其對T1DM發(fā)病的干預。
　　目的：
　　研究LPS干預對非肥胖糖尿病(non-obese diabetic,NOD)鼠自發(fā)性自身免疫性糖尿病發(fā)展的影響及其可能機制,重點觀察TLR4表達的變化,探討TLR4

3、在LPS對T1DM干預效應中的作用。
　　方法：
　　7-8周齡雌性NOD小鼠隨機分為3組:對照組、LPS單次干預組、LPS多次干預組,每組20只。LPS單次干預組于NOD小鼠7-8周齡腹腔注射LPS10μg/只,之后每周腹腔注射生理鹽水0.2ml/只,連續(xù)3周;LPS多次干預組于7-8周齡開始,每周每只NOD小鼠腹腔注射10μgLPS,連續(xù)4周;對照組于7-8周齡開始,每周腹腔注射生理鹽水0.2ml/只,連續(xù)4周。于最后一

4、次干預后,每組隨機選取8只11-12周齡NOD小鼠行腹腔內葡萄糖耐量試驗、取血清測定細胞因子水平、處死后取胰腺、胸腺及脾臟,行胰腺病理組織學檢查、分離脾臟淋巴細胞,測定T淋巴細胞增殖反應及CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞(Regulatory T cells,Treg)比例、分離骨髓來源的樹突狀細胞(dendritic cells,DC)并測定其表型、同時測定胰腺、胸腺、脾臟組織及DCTLR4表達。每組剩余動物繼續(xù)飼養(yǎng)至26-

5、27周齡,每周2次尾靜脈取血,測定血糖了解糖尿病發(fā)病情況。
　　結果：
　　LPS多次干預能夠改善11-12周齡NOD鼠糖耐量并顯著降低糖尿病發(fā)病率;LPS單次干預組僅能改善糖耐量。LPS干預不保護或逆轉NOD小鼠胰島炎,也不影響胰島數(shù)目,對Th2型細胞因子水平、DC表型以及脾臟TLR4表達均無顯著影響,但能抑制Th1型細胞因子生成及脾淋巴細胞增殖反應、促進CD4+CD25+Foxp3+Treg分化、并顯著下調胸腺、DC以及

6、胰腺TLR4表達。
　　結論：
　　LPS干預(特別是多次干預)通過延緩胰島炎向糖尿病發(fā)病的惡化過程發(fā)揮T1DM保護作用。其保護機制可能與兩種重要的免疫耐受相關細胞Treg和DC有關-一方面LPS促進Treg分化,促進免疫耐受的形成;另一方面通過下調DCTLR4表達,控制LPS信號通路的活化,而對抗DC的致免疫作用。
　　第二部分：紅活麻總香豆素通過下調TLR4信號通路發(fā)揮自身免疫性糖尿病保護作用
　　實驗背景：

7、
　　民族藥紅活麻(Urtica dentata Hand,UDH)為蕁麻科艾麻屬植物珠芽艾麻(Laportea bulbifera(Sieb.et.Zucc.)Wedd)的干燥根,因具有抗炎和免疫調節(jié)作用,在以類風濕關節(jié)炎為代表的自身免疫性疾病治療方面的應用由來已久,其主要活性成分為香豆素類。
　　目的：
　　研究紅活麻總香豆素(Total coumarins,TC)對自身免疫性糖尿病發(fā)病的影響。
　　方法：<

8、br>　　8周齡雌性NOD小鼠隨機分為4組:對照組、TC低、中、高劑量組。給藥低、中、高劑量組分別以37.5、75和150mg/kgTC隔日灌胃給藥,對照組同法給予等容積生理鹽水,連續(xù)4周,每組20只。于最后一次給藥后,每組隨機選取8只12周齡NOD小鼠行腹腔內葡萄糖耐量試驗,取血清測定細胞因子水平,處死后取胰腺、胸腺及脾臟,行胰腺病理組織學檢查、分離脾臟淋巴細胞,測定T淋巴細胞增殖反應及CD4+CD25+Foxp3+Treg比例、分離

9、骨髓來源DC并測定其表型、測定胸腺、脾臟組織Foxp3表達、胰腺、胸腺、脾臟組織及DCTLR4表達、并檢測TLR4相關信號分子mRNA表達。每組剩余動物繼續(xù)飼養(yǎng)至26周齡,每周2次尾靜脈取血,測定血糖了解糖尿病發(fā)病情況。
　　結果：
　　與對照組相比,TC連續(xù)給藥4周能夠改善NOD鼠胰島炎癥、提高糖耐量并顯著降低糖尿病發(fā)病率。TC可抑制脾T淋巴細胞增殖反應、誘導Th2偏向性細胞因子反應、促進CD4+CD25+Foxp3+Tr

10、eg分化和Foxp3mRNA表達。TC給藥組DC表型呈現(xiàn)MHC-II和CD86分子低表達狀態(tài)。此外,TC給藥組胰腺、胸腺、脾臟組織及DCTLR4表達顯著下調。TLR4下游關鍵分子髓樣分化因子(myeloid differentiation factor,MyD)88、核因子(nuclear factor,NF)-κB,IL-1β,干擾素β誘導性toll–IL-1受體相關銜接蛋白(Toll–IL-1 receptor domain-con

11、taining adaptor inducing interferon-β,TRIF),TRIF相關銜接分子(TRIF-related adaptor molecule,TRAM),干擾素調節(jié)因子(interferon regulatory factor,IRF)-3及IFN-β在TC給藥組均顯著下調,提示TC對TLR4下游MyD88依賴性和非依賴性信號通路均有抑制作用。
　　結論：
　　TC通過下調TLR4信號通路發(fā)揮自身

12、免疫性糖尿病保護作用。
　　第三部分：Kv1.3相關DCTLR4信號通路的體外研究與藥物干預
　　實驗背景：
　　DC表面TLR4在調控DC致免疫和致耐受作用中的作用至關重要。而Shaker相關電壓門控Kv1.3(KCNA3)在DC功能調控方面也具有重要作用。公認的TLR4配體LPS刺激DC成熟的過程中伴有Kv1.3的上調,而Kv1.3抑制劑能夠抵消LPS的刺激作用。
　　目的：
　　利用小鼠DC2.4細胞

13、系,體外研究TLR4與Kv1.3的相互作用,并在此基礎上研究紅活麻總香豆素對DCTLR4/Kv1.3信號通路的影響。
　　方法：
　　對數(shù)生長期DC2.4細胞分為4組:LPS處理組、LPS+TC處理組、LPS+Kv1.3抑制劑處理組及空白組,FACS法測定各組DC上MHC-II表達,Western blot法測定DCTLR4及Kv1.3表達水平的改變。
　　結果：
　　DC2.4細胞結構性表達TLR4及Kv1.3

14、,而LPS能夠顯著誘導二者在DC上的表達。Kv1.3抑制劑能夠顯著抑制Kv1.3的蛋白表達,并顯著對抗TLR4配體LPS誘導的DC上MHC-II的上調,但對LPS誘導的DCTLR4表達水平并無顯著影響。體外給予50μg/ml紅活麻總香豆素能夠顯著抑制LPS誘導的DC上MHC-II、TLR4及Kv1.3表達。
　　結論：
　　Kv1.3與DCTLR4信號通路相關;Kv1.3也參與紅活麻總香豆素對DCTLR4信號通路的干預過程。