RUNX3在瘢痕疙瘩發(fā)病機制中的作用及其表達與Pa-PDT治療療效的關系.pdf

1、瘢痕疙瘩是一種特殊的瘢痕類型，是一種皮膚上的結締組織腫瘤，在形態(tài)學方面，其腫塊隆起于皮膚的表面，表面光滑，質地堅硬，界限欠規(guī)則，在組織學方面，成纖維細胞過度增生，細胞外基質成分增加，膠原蛋白過度沉積，具有過度生長、病變的發(fā)展超出原損傷界限、呈瘤樣增生，且鄰近組織也受到相應的侵犯、始終不發(fā)生退化和單純手術治療后常出現復發(fā)現象，在臨床上，伴有不同程度的瘙癢和疼痛，常造成功能障礙和外形破壞而影響美觀和病人的心理，嚴重的損害了病人的生活質量。<

2、br>　　光動力療法是醫(yī)治惡性腫瘤的方法之一，它在不損害健康組織的情況下，在腫瘤組織中利用一種光敏劑的光動力殺傷癌細胞的作用和選擇性聚集作用，造成腫瘤組織的特定部位受到損害。光敏劑的性質可直接影響光動力療法的治療效果，因此光敏劑的發(fā)展對光動力療法的發(fā)展具有重要的意義。脫鎂葉綠酸（Pa）一個新的成熟的光敏劑，有抗癌活躍性和最低毒性已被很多研究者所報道。脫鎂葉綠酸-光動力療法（Pa-PDT）它在各種類型的癌癥中增加細胞凋亡和減少癌細胞的增殖

3、能力。Pa-PDT治療瘢痕疙瘩的療效及其作用機制的研究尚無報告。因此采用Pa-PDT，探索治療瘢痕疙瘩的新的方法。最近研究的腫瘤治療重點在是患者的個性化治療。分析每個瘢痕疙瘩病人，根據病人的需要制定和實施有效的治療方案。最近,一些研究人員已經表明,runt-related轉錄因子3(RUNX3)是一種預測Pa-PDT敏感性的分子目標。
　　目的:闡明RUNX3在瘢痕疙瘩發(fā)病機制中的作用,探討Pa-PDT對瘢痕疙瘩的治療效果,并進一

4、步研究RUNX3表達對瘢痕疙瘩Pa-PDT敏感性的影響。同時用瘢痕疙瘩成纖維細胞建立瘢痕疙瘩裸鼠模型。
　　方法：
　　1）利用瘢痕疙瘩病理組織原代培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細胞；
　　2）利用免疫細胞化學法檢測原代培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細胞中Vimentin,α-SMA及type I collagen的表達；
　　3）利用3-4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl Tetr-azoli

5、um bromide(MTT) assay探討Pa對瘢痕疙瘩成纖維細胞的細胞毒性并分析細胞Pa-PDT的可行性；
　　4）實時定量PCR分析瘢痕疙瘩發(fā)病機制和凋亡相關基因：比較性地研究用Pa-PDT處理過和未處理過的成纖維細胞中增殖細胞核抗原、I型膠原蛋白表達；
　　5）ROS生成：熒光探針,2′7′dichlorofluorescin diacetate dye是用于檢測每一組表達的成纖維細胞中細胞內 ROS水平；

6、　　6） Pa-PDT后評估凋亡細胞死亡：比較性的研究僅用Pa處理過的成纖維細胞和接受Pa-PDT處理過的成纖維細胞兩組中凋亡細胞死亡；
　　7）Pa-PDT導致凋亡相關蛋白表達：通過免疫印跡分析，比較性的研究 Pa處理過的成纖維細胞組和Pa-PDT處理過的成纖維細胞組中的半胱天冬酶-3,活化型半胱天冬酶-3和降解產物表達；
　　8）外科手術切除的瘢痕疙瘩樣本的免疫組織化學，檢測瘢痕疙瘩組織中RUNX3的表達及其意義；

7、>　　9）利用免疫細胞化學法檢測原代培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細胞中RUNX3的表達；
　　10）利用針對RUNX3小干擾RNA壓低 RUNX3的表達，觀察瘢痕疙瘩纖維細胞PCNA表達的改變；
　　11）利用實時定量PCR檢測Pa-PDT對瘢痕疙瘩成纖維細胞 RUNX3表達的影響；
　　12）比較觀察Pa-PDT對RUNX3陽性細胞株及陰性細胞株的療效，針對Pa-PDT后瘢痕疙瘩成纖維細胞中PCNA，I型膠原蛋白的表達，RO

8、S生成及凋亡發(fā)生作比較；
　　13）在瘢痕疙瘩成纖維細胞中利用針對RUNX3小干擾RNA壓低 RUNX3的表達，觀察Pa-PDT療效的改變；
　　14）建立瘢痕疙瘩成纖維細胞裸鼠動物模型：體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細胞與細胞基底膜基質膠（Matrigel）混合后以細胞濃度為1.0×107/ml、3.0×107/ml、5.0×107/ml接種于裸鼠皮下，接種量為0.1ml，觀察瘤體形成和生長情況，篩選適宜接種濃度；用已形成的瘢痕

9、疙瘩瘤體進行體內傳代，建立移植模型。
　　結果：
　　1）成功培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細胞并命名為KF1，KF2，KF3，KF4及KF5；
　　2)原代培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細胞中檢測到波形蛋白,α-SMA,和I型膠原蛋白的表達；
　　3）Pa對四組瘢痕疙瘩成纖維細胞呈現較低的細胞毒性及充分的積累；
　　4）Pa-PDT嚴重影響瘢痕疙瘩成纖維細胞活力；
　　5）經過Pa-PDT后瘢痕疙瘩成纖維細胞中增殖細胞核

10、抗原、I型膠原蛋白表達減少；
　　6）經過Pa-PDT后瘢痕疙瘩成纖維細胞中ROS生成顯著增高；
　　7）經過Pa-PDT后瘢痕疙瘩成纖維細胞中調亡細胞數量顯著增多；
　　8）經過Pa-PDT后瘢痕疙瘩成纖維細胞中cleaved caspase-3及cleaved-PARP的表達顯著增高；
　　9）RUNX3的核表達在16個(50％)瘢痕疙瘩組織樣本中被發(fā)現，但在6個正常皮膚樣本中卻沒有發(fā)現。在瘢痕疙瘩組織中 R

11、UNX3的核表達與瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖指數及伴有臨床癥狀正相關；
　　10) RUNX3的蛋白表達可在KF1，KF2中檢測到，但在 KF3，KF4及KF5中未檢測到RUNX3蛋白表達；
　　11）在瘢痕疙瘩成纖維細胞中利用針對RUNX3小干擾RNA壓低 RUNX3的表達，可觀察到PCNA表達降低；
　　12）Pa-PDT可引起瘢痕疙瘩成纖維細胞中 RUNX3表達降低；
　　13）Pa-PDT后與RUNX3陰性

12、細胞株相比PCNA及type I collagen的降低，ROS生成及凋亡細胞的增多都在RUNX3陽性細胞株更明顯；
　　14）在瘢痕疙瘩成纖維細胞中利用針對RUNX3小干擾RNA壓低 RUNX3的表達可降低Pa-PDT的細胞毒性；
　　15）成功建立瘢痕疙瘩成纖維細胞裸鼠動物模型，并篩選出較適宜的細胞接種濃度為5.0×107/ml，體內傳代后瘤體依然存活增大，二者組織病理未見明顯差異。
　　結論：
　　1）經過

13、Pa-PDT后瘢痕疙瘩成纖維細胞中ROS生成顯著增加，凋亡細胞的數量顯著增多，抑制成纖維細胞增殖；
　　2）在瘢痕疙瘩組織中RUNX3的核表達與瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖指數及伴有臨床癥狀正相關；
　　3）Pa-PDT嚴重影響瘢痕疙瘩成纖維細胞生存率。此細胞毒性明顯依賴于 RUNX3的表達；
　　4）ROS生成和凋亡細胞的數量的增多與RUNX3表達正相關；
　　5）裸鼠皮下接種人瘢痕疙瘩成纖維細胞可建立瘢痕疙瘩裸鼠