脯氨酸羥化酶Ⅱ對脂肪間充質干細胞旁分泌介導的心肌保護作用的影響及其機制研究.pdf

1、目的：觀察RNA干擾脂肪間充質干細胞脯氨酸羥化酶II(PHD2)對其旁分泌介導的心肌保護作用的影響及其機制。
　　方法：本實驗原代提取人脂肪間充質干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADSCs)，并采用流式細胞術(flow cytometry, FCM)檢測表面分子進行鑒定。包裝脯氨酸羥化酶II(PHD2) RNA干擾載體的慢病毒轉染ADSCs使其PHD2低表達。用H2O2(10

2、0μM)刺激新生大鼠心肌細胞(neonatal rat ventricular myocytes, NRVMs)6小時，建立心肌細胞氧化損傷模型。實驗將NRVMs分為5組：正常對照組，H2O2氧化損傷模型組，ADSC-條件培養(yǎng)基（conditioned medium, CM）組，空載體-ADSC-CM組，PHD2干擾-ADSC-CM組，其中后四組均用H2O2處理。ADSC條件培養(yǎng)液(CM)預處理NRVMs，采用末端脫氧核苷酰基轉移酶介導

3、性dUTP切口末端標記(TUNEL)染色和免疫印跡法檢測caspase-3蛋白表達觀察H2O2誘導的心肌細胞凋亡。ELISA方法檢測ADSC-CM中的促存活細胞因子血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、肝細胞生長因子-1(hepatocyte growth factor, HGF)、間質細胞衍生因子1(stromal-derived factor1, SDF-1)、胰島素樣

4、生長因子-1(insulin growth factor-1, IGF-1)和分泌型卷曲相關蛋白2(secreted frizzled-related protein2, sFRP2)。
　　結果：1.采用流式細胞術檢測ADSCs細胞表面分子，其中CD44，CD73，CD90，CD105表達均為陽性，表達陽性細胞比例分別為CD4496.07％，CD7399.81%，CD9099.22%， C10599.91%；CD34，CD45表

5、達陽性細胞比例分別為0.96%和0.15%，表達幾乎為陰性。流式細胞儀檢測結果顯示細胞均一性較好，表型表達與既往研究報道結果一致，因此基本可以斷定本實驗所分離、培養(yǎng)出的細胞主要為ADSCs，且純度較高。
　　2. ADSCs采用第3代，待融合度達50～60%，進行空載體Lenti-GFP和Lenti-shPHD2-GFP慢病毒轉染，感染效率（綠色熒光陽性率）達90%以上。
　　3.空載體-GFP和PHD2干擾慢病毒載體轉染A

6、DSCs成功后，免疫印跡法檢測ADSCs的PHD2的蛋白表達，PHD2干擾-ADSC組較空載體-GFP組降低約70%(P<0.05)。
　　4. H2O2處理導致心肌細胞明顯凋亡，TUNEL染色檢測細胞凋亡比率為（71.7±0.9）%。在ADSC-CM組、空載體-ADSC-CM組，其條件培養(yǎng)液預處理在一定程度上均減弱H2O2誘導的心肌細胞凋亡，較H2O2氧化損傷模型組TUNEL陽性率分別降低12.9%和16.9%。PHD2干擾-A

7、DSC-CM較空載體-ADSC-CM預處理明顯減少NRVM的凋亡，TUNEL陽性率降低30.3%(P<0.05)。
　　5. H2O2處理導致心肌細胞明顯凋亡，caspase-3蛋白表達較對照組升高64.2%。在ADSC-CM組、空載體-ADSC-CM組，其條件培養(yǎng)液預處理在一定程度上均減弱 H2O2誘導的心肌細胞凋亡，較H2O2氧化損傷模型組caspase-3蛋白表達分別降低16.5%和24.1%。PHD2干擾-ADSC-CM較

8、空載體-ADSC-CM預處理明顯減少NRVM的凋亡，caspase-3蛋白表達降低24.8%(P<0.05)。
　　6. PHD2干擾后ADSC-CM中細胞因子IGF-1和sFRP2明顯增加，分別為空載體-ADSC-CM的2.09倍（P<0.05）和1.76倍（P<0.05）。IGF-1中和抗體干預后，與PHD2干擾-ADSC-CM組相比，PHD2干擾-ADSC-CM-IGF-1抗體中和組TUNEL陽性率明顯升高(P<0.05)；

9、sFRP2中和抗體干預后，與PHD2干擾-ADSC-CM組相比，PHD2干擾-ADSC-CM-IGF-1抗體中和組caspase-3蛋白表達明顯升高(P<0.05)。說明IGF-1和sFRP2中和抗體干預后PHD2干擾-ADSC-CM的的抗心肌細胞凋亡作用明顯受抑制。
　　結論：1. ADSC通過旁分泌作用抑制超氧應激誘導的心肌細胞損傷。2. PHD2干擾后增強了ADSC旁分泌介導的心肌保護作用，其機制可能為增加ADSC促存活細胞