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文檔簡介
1、目的:觀察RNA干擾脂肪間充質干細胞脯氨酸羥化酶II(PHD2)對其旁分泌介導的心肌保護作用的影響及其機制。
方法:本實驗原代提取人脂肪間充質干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADSCs),并采用流式細胞術(flow cytometry, FCM)檢測表面分子進行鑒定。包裝脯氨酸羥化酶II(PHD2) RNA干擾載體的慢病毒轉染ADSCs使其PHD2低表達。用H2O2(10
2、0μM)刺激新生大鼠心肌細胞(neonatal rat ventricular myocytes, NRVMs)6小時,建立心肌細胞氧化損傷模型。實驗將NRVMs分為5組:正常對照組,H2O2氧化損傷模型組,ADSC-條件培養(yǎng)基(conditioned medium, CM)組,空載體-ADSC-CM組,PHD2干擾-ADSC-CM組,其中后四組均用H2O2處理。ADSC條件培養(yǎng)液(CM)預處理NRVMs,采用末端脫氧核苷酰基轉移酶介導
3、性dUTP切口末端標記(TUNEL)染色和免疫印跡法檢測caspase-3蛋白表達觀察H2O2誘導的心肌細胞凋亡。ELISA方法檢測ADSC-CM中的促存活細胞因子血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、肝細胞生長因子-1(hepatocyte growth factor, HGF)、間質細胞衍生因子1(stromal-derived factor1, SDF-1)、胰島素樣
4、生長因子-1(insulin growth factor-1, IGF-1)和分泌型卷曲相關蛋白2(secreted frizzled-related protein2, sFRP2)。
結果:1.采用流式細胞術檢測ADSCs細胞表面分子,其中CD44,CD73,CD90,CD105表達均為陽性,表達陽性細胞比例分別為CD4496.07%,CD7399.81%,CD9099.22%, C10599.91%;CD34,CD45表
5、達陽性細胞比例分別為0.96%和0.15%,表達幾乎為陰性。流式細胞儀檢測結果顯示細胞均一性較好,表型表達與既往研究報道結果一致,因此基本可以斷定本實驗所分離、培養(yǎng)出的細胞主要為ADSCs,且純度較高。
2. ADSCs采用第3代,待融合度達50~60%,進行空載體Lenti-GFP和Lenti-shPHD2-GFP慢病毒轉染,感染效率(綠色熒光陽性率)達90%以上。
3.空載體-GFP和PHD2干擾慢病毒載體轉染A
6、DSCs成功后,免疫印跡法檢測ADSCs的PHD2的蛋白表達,PHD2干擾-ADSC組較空載體-GFP組降低約70%(P<0.05)。
4. H2O2處理導致心肌細胞明顯凋亡,TUNEL染色檢測細胞凋亡比率為(71.7±0.9)%。在ADSC-CM組、空載體-ADSC-CM組,其條件培養(yǎng)液預處理在一定程度上均減弱H2O2誘導的心肌細胞凋亡,較H2O2氧化損傷模型組TUNEL陽性率分別降低12.9%和16.9%。PHD2干擾-A
7、DSC-CM較空載體-ADSC-CM預處理明顯減少NRVM的凋亡,TUNEL陽性率降低30.3%(P<0.05)。
5. H2O2處理導致心肌細胞明顯凋亡,caspase-3蛋白表達較對照組升高64.2%。在ADSC-CM組、空載體-ADSC-CM組,其條件培養(yǎng)液預處理在一定程度上均減弱 H2O2誘導的心肌細胞凋亡,較H2O2氧化損傷模型組caspase-3蛋白表達分別降低16.5%和24.1%。PHD2干擾-ADSC-CM較
8、空載體-ADSC-CM預處理明顯減少NRVM的凋亡,caspase-3蛋白表達降低24.8%(P<0.05)。
6. PHD2干擾后ADSC-CM中細胞因子IGF-1和sFRP2明顯增加,分別為空載體-ADSC-CM的2.09倍(P<0.05)和1.76倍(P<0.05)。IGF-1中和抗體干預后,與PHD2干擾-ADSC-CM組相比,PHD2干擾-ADSC-CM-IGF-1抗體中和組TUNEL陽性率明顯升高(P<0.05);
9、sFRP2中和抗體干預后,與PHD2干擾-ADSC-CM組相比,PHD2干擾-ADSC-CM-IGF-1抗體中和組caspase-3蛋白表達明顯升高(P<0.05)。說明IGF-1和sFRP2中和抗體干預后PHD2干擾-ADSC-CM的的抗心肌細胞凋亡作用明顯受抑制。
結論:1. ADSC通過旁分泌作用抑制超氧應激誘導的心肌細胞損傷。2. PHD2干擾后增強了ADSC旁分泌介導的心肌保護作用,其機制可能為增加ADSC促存活細胞
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