高氟對成釉細胞生物學特性影響的體外研究.pdf

1、地方性氟中毒是我國危害最嚴重的地方病，主要侵犯牙齒和骨骼，造成氟斑牙和氟骨癥，嚴重危害人的健康和美觀。氟斑牙是慢性氟中毒早期最常見的癥狀，產生氟斑牙最主要的原因是機體在釉質發(fā)育期間長期攝入了過量的氟，導致釉質發(fā)育障礙。其臨床表現為同一時期萌出的牙齒釉質上出現白堊色到褐色的斑塊，嚴重者有釉質缺損。研究表明，氟離子可以通過多種途徑影響成釉細胞，包括細胞的增殖、凋亡，釉基質蛋白的合成和分泌，以及蛋白酶活性等。然而，氟離子對不同分化階段的成釉細

2、胞作用是否一致，其作用機理是什么尚不清楚。
　　本研究選擇小鼠成釉細胞樣細胞系LS8作為研究對象，用視黃酸和地塞米松誘導LS8細胞建立體外成釉細胞的分化模型。通過實時定量PCR檢測兩種釉基質蛋白和兩種蛋白酶的mRNA的表達水平，熒光標記的白蛋白檢測細胞內吞功能，DND-167染料檢測細胞內pH值等多種方法，比較誘導組細胞和對照組細胞的各種生物學特性的差異。結果發(fā)現，與對照組相比，誘導組細胞釉原蛋白和釉蛋白的表達分別下調了64％和6

3、1.1％（P<0.05），Mmp20和Klk4mRNA的表達分別上調了1.42倍和2.41倍（P<0.05）；誘導組細胞內吞的白蛋白的平均熒光強度為對照組的1.6倍（P<0.05），誘導組細胞內檢測酸性pH的平均熒光強度為對照組的1.9倍（P<0.05），以上這些特征表明視黃酸和地塞米松誘導的LS8細胞具有轉化期成釉細胞的特征，利用對照組和誘導組的LS8細胞可分別模擬成釉細胞的分泌期和轉化期的研究模型。
　　為了研究高氟對成釉細胞

4、生長和增殖的影響，本研究通過MTT實驗觀察不同濃度的氟離子對LS8細胞增殖的影響，發(fā)現隨著NaF濃度的增高，LS8細胞的增殖活性降低，這種作用在NaF作用72h時更為明顯。當NaF濃度達到2mmol/L時，加氟后24h和48h細胞死亡率分別為30％和49％，而當NaF作用細胞72h，0.5mmol/L的濃度就可以引起37％的細胞死亡，說明毫摩爾劑量的氟離子會抑制成釉細胞的增殖。由此，我們確定了本研究高濃度氟離子的具體濃度為2mmol/L

5、。細胞凋亡實驗結果顯示，視黃酸/地塞米松誘導組（20.43％）和NaF誘導組（19.01％）凋亡細胞（包括早期凋亡和晚期凋亡細胞）和死亡細胞的總比例均比對照組（14.23％）高（P<0.01），而RA/DEX+NaF+誘導組（10.83％）細胞凋亡/死亡則較對照組有所減少（P<0.01）。為了進一步準確測量懸浮細胞的活性，我們利用流式細胞儀來計數培養(yǎng)液中的懸浮細胞，RA/DEX+NaF+誘導組懸浮細胞數目最多，約為對照組的4.25倍（P

6、<0.01）；同時采用掃描電鏡觀察這些細胞表面的超微結構特征，發(fā)現RA/DEX+NaF+誘導組細胞失去了正常細胞的表面形態(tài)特征，細胞表面褶皺消失而變平，多數細胞傾向于連成一片，且其細胞平均直徑較對照組顯著變?。≒<0.01）。通過以上結果我們認為高濃度的氟離子影響成釉細胞的生物學特性，如增殖和死亡，并且對轉化期成釉細胞的作用更為明顯。
　　內吞作用是成熟期成釉細胞的重要特征，內吞功能異常在氟斑牙的發(fā)生中扮演著重要的角色。那么高氟對

7、不同分化階段的成釉細胞的內吞功能有何影響？為此，我們設計了吞噬實驗，利用活細胞工作站動態(tài)觀察細胞的吞噬活動，RA/DEX和NaF誘導組細胞發(fā)生吞噬作用的細胞數多于對照組（10個和21個vs.6個），并且吞噬活動速度更快。RA/DEX+NaF+誘導組細胞發(fā)生吞噬作用的細胞數最多，80％以上的細胞都發(fā)生了吞噬作用，并且其吞噬速度在四組細胞中最快，絕大多數細胞都在15min內開始了吞噬活動，本實驗說明高濃度的氟離子可以促進轉化期成釉細胞的吞噬

8、功能。
　　目前還沒有有力的證據表明存在特異的氟離子通道，一般認為，氟離子是通過氯離子通道來進出細胞的，那么氟對成釉細胞生物學特性的影響是否也是通過氯離子通道來完成的呢？為了驗證這一假說，首先我們確定了LS8細胞中存在的氯離子通道類型；RT-PCR結果表明，成釉細胞表達8種ClC家族氯通道（Clcn1～7，Clcnkb），不表達Cftr。我們用2mmol/L的氟離子誘導LS8細胞后，通過實時定量PCR篩選對氟離子敏感的ClC家族氯

9、通道，作用時間為24h和48h時，各型ClC通道的表達均有所增高，而當作用時間延長為72h，Clcn1、Clcn3和Clcn7三型ClC通道的表達分別增加了3.0倍、2.9倍和2.3倍（P<0.05）。通過細胞內pH檢測，作用時間為24h、48h和72h時，反映細胞內酸性pH的平均藍色熒光強度分別為對照組細胞的2.4倍、2.6倍和2.0倍（P<0.01），通過大量查閱文獻我們發(fā)現，ClC-3和ClC-7與細胞內酸性pH的調節(jié)密切相關，由

10、此，我們推斷Clcn3和Clcn7可能對氟離子的作用更為敏感，其具體的機理我們將在下一步的研究中闡明。
　　通過本研究，我們建立了研究氟離子對成釉細胞影響的體外實驗模型，觀察到了高濃度的氟離子對轉化期成釉細胞作用更為敏感，發(fā)現氟離子通過干擾細胞的吞噬活動促進了細胞的凋亡與死亡，其機理與氯離子通道介導的細胞內酸化調節(jié)有關。本研究為氟斑牙的生物學產生機理增加了新的研究內容，從氯離子通道的角度重新審視了氟離子影響成釉細胞生物學特性的機制