重組人cTnI優(yōu)化表達和純化工藝建立及其抗體制備.pdf

1、人心肌肌鈣蛋白I（human cardiac troponin I，cTnI）是檢測心肌損傷的重要標志物，目前臨床使用的檢測cTnI的試劑盒，由于抗體針對不同的抗原表位和抗原結合力不同，cTnI片段具有不同的清除率和降解速度，以及使用了不同的標準品，這些因素使檢測結果間存在很大差異，據(jù)研究報道，不同方法之間檢測的差異可達100倍；因此，開展cTnI檢測的標準化研究工作是十分有必要的。然而，cTnI的來源十分有限，制約了cTnI檢測技術方

2、法的改進和檢測標準化研究，因此采用基因工程的方法，構建表達載體，并大規(guī)模的表達，是解決cTnI來源有限的一種有效途徑。
　　 本研究的目的是在已構建的人心肌肌鈣蛋白I的原核表達載體的基礎上，優(yōu)化表達條件，提高目的蛋白在大腸桿菌中表達率，并建立純化的方法，制備抗cTnI的高親和力單克隆抗體及多克隆抗體。
　　 影響cTnI在大腸桿菌（E.coli）表達的因素包括溫度、pH、搖床轉速、IPTG濃度、誘導時間、誘導時機的選擇和

3、培養(yǎng)基的組成，為全面考察各因素對cTnI蛋白表達的影響，采用單因素設計和正交試驗設計都不能考察各因素間的交互作用，且工作量大，因此本研究采用兩步試驗設計，PBD（Plackett Burman Design）實驗考察各因素間的對cTnI蛋白影響的大小，響應曲面法（RSM）用于優(yōu)化表達條件，通過構建回歸方程預測cTnI的表達率，并獲得最優(yōu)表達條件。該方法可以考察各因素對cTnI蛋白表達的影響，同時獲得最優(yōu)的表達條件，且減少了工作量。

4、>　　 采用硫酸銨沉淀和離子交換層析法純化cTnI蛋白，經SDS-PAGE蛋白電泳檢測目的蛋白，純度達到99％以上。以純化的cTnI蛋白為抗原，免疫BALB/c小鼠，取脾細胞同骨髓瘤細胞Sp2/0細胞融合，制備單克隆抗體；以cTnI為抗原免疫新西蘭大耳白兔制備多克隆抗體，并檢測制備抗體的性質。
　　 經過優(yōu)化條件及純化，獲得了大量高純度的cTnI蛋白，并制備了分泌高親和力的抗cTnI的單克隆抗體雜交瘤細胞株，分別命名為：C58