組蛋白乙酰化酶亞型在小鼠心臟發(fā)育中的時空表達.pdf

1、先天性心臟病(congenital heart disease，CHD)簡稱先心病，是小兒時期最常見的心血管畸形，是人類最常見的出生缺陷。隨著影像學和外科與介入手段的不斷發(fā)展，對先心病的診斷和治療有了很大進步，但對其發(fā)病機制了解甚少，多集中在心臟發(fā)育相關基因研究方面。心臟發(fā)育是一個極其復雜的過程，它涉及胚胎發(fā)育過程中眾多基因在不同時間和空間上的順序精確表達，并受多種轉錄因子調控[1]。該過程的實現并不是只由基因序列所決定，很大程度上由染

2、色質構象改變所決定[2]。這種染色質構象改變又叫作染色質重塑 (chromatinremodeling)，屬于表觀遺傳學(epigenetic)研究范疇[3]，而目前關于心臟發(fā)育表觀遺傳學機制研究甚少，那么在調控基因表達層面上，從表觀遺傳學的全新角度認識心臟發(fā)育機制具有重大科學意義。 表觀遺傳學包括DNA修飾、組蛋白修飾和非編碼RNA調控[4]三個層面。近年來研究發(fā)現組蛋白乙?；揎椩谂咛グl(fā)育中起重要調控作用。組蛋白乙?；?h

3、istone acetyltransferases，HATs)是催化組蛋白引起乙酰化修飾的酶，決定心肌組織中組蛋白乙?；揎椝?，從而影響心臟發(fā)育基因的時序表達調控。因此，要闡明心臟發(fā)育的表觀遺傳調控模式，需從研究發(fā)育心臟中HATs的時空表達變化入手。 目的： 本研究通過檢測與心臟有關的5種HATs亞型-p300、CBP、GCN5、PCAF和SRC1在發(fā)育心臟中的時空表達變化，建立胚胎心臟發(fā)育過程中不同HATs亞型時間劑

4、量曲線，初步探討各HATs亞型與心臟發(fā)生發(fā)育的關系。 材料與方法選取胎齡7.5～18天、出生1天和3月成年昆明小鼠正常心臟，通過大體觀察和石蠟切片HE染色技術詳細描述心臟發(fā)育的形態(tài)學變化；利用免疫組織化學法和RT-PCR技術動態(tài)檢測p300、CBP和GCN5在心臟發(fā)育過程中的蛋白表達分布和mRNA時序性表達變化；采用免疫組織化學法和Western blot技術動態(tài)分析PCAF和SRC1在小鼠心臟發(fā)育過程中的蛋白表達時空變化規(guī)律，

5、建立心臟發(fā)育過程中不同HATs亞型的時間劑量曲線。 結果： 1.小鼠胚胎(embryo E)7.5天出現新月形心臟原基，E8.5～E9.5出現原始心管并環(huán)化， E10.5房室管形成并出現心內膜墊和突入心室腔的小梁，E11.5～E13.5房間隔形成，E11.5～E14.5室間隔形成，E12.5～E15.5房室瓣形成，E11.5～E13.5流出道被分割為主動脈和肺動脈，E11.5～E16.5心肌細胞分化增殖使心壁致密變厚，E

6、16.5～生后1天心肌細胞增殖增大使心壁更厚且心臟體積增大明顯，生后心臟隨小鼠生長而增大，心肌細胞不再增殖。心肌細胞在胚胎時期為多邊形，生后一周內逐漸過渡到成年時期的短柱狀。 2.p300和CBP在心臟發(fā)育過程中的時空表達變化：(1)免疫組織化學結果顯示：p300在心臟發(fā)育整個時期心臟各部分均有很強或較強表達。而CBP在E7.5不表達；E8.5～E9.5的心管中較強表達；E10.5～E16.5及E18和生后1天仔鼠期心肌組織較強

7、表達，房室瓣和小梁網弱表達，室間隔肌部較弱表達而膜部表達更弱；3月成年鼠心肌和小梁較弱表達，室間隔極弱表達。與同期同心臟區(qū)域的p300相比，CBP有相對低的陽性細胞表達率，差異有統計學意義(P＜0.05)；(2)RT-PCR 結果顯示：E10.5天以后的發(fā)育心臟中，p300 mRNA在E10.5～E11.5出現高峰表達，CBP mRNA在E10.5～E12.5出現高峰表達，在隨后的心臟發(fā)育時間點，二者表達呈逐漸下降趨勢。 3.

8、GCN5在心臟發(fā)育過程中的時空表達變化：(1)免疫組織化學結果顯示：GCN5在E7.5～E9.5心臟原基中不表達；E10.5～E11.5發(fā)育心臟中廣泛弱表達，心內膜墊相對強表達；E12.5后發(fā)育時期心內膜墊及其發(fā)育形成的室間隔膜部和房室瓣相對強表達，心肌組織弱表達。(2)RT-PCR結果顯示：E10.5天以后的發(fā)育心臟中，GCN5 mRNA在E10.5～E11.5出現高峰表達， E12.5～E15.5表達水平下降，E16.5至成年鼠期表

9、達極低。 4.PCAF在心臟發(fā)育過程中的時空表達變化：(1)免疫組織化學結果顯示：PCAF 在E7.5～E9.5的心臟原基中廣泛弱表達；E10.5～生后1天新生鼠期心肌膜較強表達，心內膜、房室瓣和小梁網較弱表達，室間隔肌部弱表達，室間隔膜部極弱表達；3月成年鼠心肌和小梁弱表達，間隔極弱表達。(2)Western blot結果顯示：E10.5天以后的發(fā)育心臟中，PCAF蛋白在E10.5已有相對高表達，E11.5達到表達高峰，此后表

10、達逐漸降低，在E13.5～E15.5和E16.5～生后1天仔鼠期出現兩個表達平臺期，在成年鼠期心臟中表達最低。 5.SRC1在心臟發(fā)育過程中的時空表達變化：(1)免疫組織化學結果顯示：SRC1在E7.5心臟原基中不表達；E8.5～E9.5的心管中微弱表達；E10.5后心臟發(fā)育各個階段，小梁弱表達，心臟其它所有區(qū)域均較強而廣泛表達。(2)Western blot結果顯示：E10.5天以后的發(fā)育心臟中，SRC1蛋白在E10.5表達較低，E1