顆粒裂解肽G13結構域及牛乳鐵蛋白肽釀酒酵母分泌表達體系構建.pdf

1、牛乳鐵蛋白肽(Bovine Lactoferricin，LfcinB)是牛乳鐵蛋白經(jīng)胃蛋白酶作用后從N-末端釋放的結構域，含25個氨基酸殘基，具有抑菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、調節(jié)機體免疫等作用。由于其天然來源有限，人工化學合成價格昂貴如何通過基因工程技術生產(chǎn)LfcinB，以滿足研究和應用的需要，成為研究的熱點。本實驗根據(jù)釀酒酵母密碼子偏好設計LfcinB基因片段，人工合成LfcinB基因并構建重組質粒pYES2-α-LfcinB，轉化

2、到大腸桿菌DH5α中擴增。提取純化重組質粒并將其轉化到釀酒酵母宿主菌INVSc1中，通過尿嘧啶缺陷篩選培養(yǎng)基篩選被轉化的酵母菌，接種于尿嘧啶缺陷選擇培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)，添加半乳糖誘導表達目的蛋白。通過抑菌試驗研究LfcinB的性質，并根據(jù)抗生素微生物效價測定法中的管碟法一劑量法測LfcinB的微生物效價，結果表明:重組表達質粒pYES2-α-LfcinB經(jīng)雙酶切和測序證明構建正確，收集濃縮誘導后的蛋白進行Tricine-SDS-PAGE電泳

3、檢測，證實目的蛋白的存在。抑茵活性試驗表明，重組LfcinB對大腸桿菌和枯草桿菌都有明顯的抑菌活性，對LfcinB的誘導表達條件優(yōu)化結果表明，在誘導溫度為26℃、誘導劑半乳糖濃度為3％的條件下誘導96h時表達產(chǎn)量最高，對LfcinB的性質研究表明其具有熱穩(wěn)定性且LfcinB中二硫鍵的存在對其抑菌活性沒有影響，本實驗成功在釀酒酵母中分泌表達了具有活性的LfcinB，為進一步研究LfcinB的生物功能及應用開發(fā)奠定了基礎。
　　G13

4、結構域是Granulysin中，含19個氨基酸殘基以及α-螺旋結構、loop結構，抗菌肽G13具有較多的正電荷與穩(wěn)定的兩性α-螺旋有助于提高殺菌活性，具有重要的研究價值。本實驗對顆粒裂解肽G13在釀酒酵母中的表達條件進行了優(yōu)化，并對G13的性質進行了研究，結果表明，用部分甘油代替棉子糖對宿主菌的生長及對G13的表達沒有影響，顆粒裂解肽G13具有熱穩(wěn)定性，G13耐酸不耐堿。
　　牛乳鐵蛋白肽LfcinB和顆粒裂解肽G13的分子量都比

5、較小，表達產(chǎn)量都不高，本研究通過構建重組pYES2-α-LG質粒，之后電擊轉化釀酒酵母INVSc1感受態(tài)細胞，通過半乳糖誘導表達獲得大量的雜合抗菌肽LfcinB-G13。抑菌活性表明其對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌都有明顯的抑菌活性，其抑菌活性比相同表達體系表達的LfcinB和G1的抑菌活性都要高，表達產(chǎn)量也有所提高，具有重要的應用價值。
　　當利用質粒載體大量而高效的表達蛋白質時，質粒載體丟失即意味著產(chǎn)量的下降，進而給生產(chǎn)帶來非常嚴重