馬立克氏病meq基因轉染CEF后部分微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和錯配修復基因的研究.pdf

1、雞馬立克氏病(Marek's Disease，MD)是一種由血清型Ⅰ型馬立克氏病毒(Marek's DiseaseⅥrus，MDV)引起的T淋巴細胞腫瘤性疾病，具有高度的傳染性。MDV是唯一已知能急性轉化的α皰疹病毒。MDV不僅可引起患雞內臟T細胞淋巴瘤、癱瘓、失明和神經(jīng)功能障礙，而且還可以引起較強的免疫抑制。微衛(wèi)星(Microsatellite，MS)是一個位點特異的DNA序列，它們的核苷酸序列較短（重復單元為1-6個堿基對），核苷酸

2、序列串聯(lián)重復10-60次，其側翼為獨特的序列。在生物體基因組中，微衛(wèi)星是有高豐度的特異性DNA標記。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(Microsatellite Instability，MSI)是由于復制錯誤（replication error，RER）引起的微衛(wèi)星等位基因的增加或丟失，造成微衛(wèi)星DNA長度發(fā)生改變，表現(xiàn)為(CA)n雙核苷酸電泳遷移率的改變，出現(xiàn)與正常基因長度不同的等位基因條帶。錯配修復基因(Mismatch Repair，MMR)是切

3、除修復未成對或錯配的堿基并通過替換正確的DNA堿基對的一組基因。本試驗對馬立克氏病meq基因轉染雞胚成纖維細胞(CEF)后部分微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和錯配修復基因表達情況進行研究。研究目的是為馬立克氏病meq基因的致瘤機制提供線索，試驗分為以下三部分。
　　第一部分是pVAX-1-meq真核表達載體的構建和在雞胚成纖維細胞中表達驗證。采用TA克隆將MEQ基因片段連接pMD19-T Vector構建出pMD19-T-meq質粒，pMD19-

4、T-meq質粒和pVAX-1真核表達質粒采用EcorRⅠ、XhoⅠ限制性內切酶雙酶切，將meq基因ORF克隆至pVAX-1質粒中，構建pVAX-1-meq真核表達質粒。轉化DH5α感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆采用pVAX-1質粒通用引物T7 primer和BGH reverse primer進行PCR驗證和EcorRⅠ、XhoⅠ限制性內切酶雙酶切驗證。將pVAX-1-meq真核表達質粒用轉染試劑轉染至雞胚成纖維細胞，并分別在轉染后的24 h

5、、48 h、72 h提取貼壁細胞總RNA，反轉錄成cDNA，根據(jù)meq基因mRNA設計引物MEQ mRNA F/R，以β-actin作為內參進行real-time PCR反應，檢測出meq基因mRNA成功在細胞內表達。比較正常細胞和轉染meq基因的細胞增殖，細胞凋亡，細胞周期的指標。轉染meq基因后細胞凋亡率并未明顯改變，細胞周期失控，G2期和S期阻滯，DNA復制過程受阻，MTT法檢測發(fā)現(xiàn)細胞活性降低，說明轉染MEQ基因至CEF細胞后并

6、未使得CEF細胞發(fā)生轉化，但會引起CEF的DNA合成受阻。
　　試驗第二部分是把構建好的pVAX-1-meq真核表達質粒用轉染試劑轉染至雞胚成纖維細胞，同時設置空載體對照組、脂質體對照組和空白對照組，并分別在轉染后的24h、48h、72h提取貼壁細胞總DNA;選取本實驗室前期初步篩選的馬立克氏病腫瘤中變化頻率較高的微衛(wèi)星標記，以此微衛(wèi)星位點設計了46對引物，以提取的DNA進行PCR擴增，采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術檢測微衛(wèi)星不穩(wěn)

7、定性，根據(jù)銀染后的結果來看，并未發(fā)現(xiàn)實驗組與對照組有明顯的微衛(wèi)星條帶差異。
　　試驗第三部分是把構建好的pVAX-1-meq真核表達質粒用轉染試劑轉染至雞胚成纖維細胞，同時設置空載體對照組、脂質體對照組和空白對照組，并分別在轉染后的24h、48h、72h以β-actin作為內參進行real-time PCR反應，檢測錯配修復相關基因MLH1，MSH2和PMS1的mRNA表達情況，結果發(fā)現(xiàn)轉染meq基因后24h，錯配修復基因MLH1