TLR4‐Src調控巨噬細胞脂質累積的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、【目的】
  動脈粥樣硬化是導致冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的主要病理基礎,氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,oxLDL)在巨噬細胞內的沉積,通過引起并增強局部慢性炎癥,加速動脈粥樣硬化過程,而局部慢性炎癥是動脈粥樣硬化發(fā)病機制的基礎。我們及其他實驗室已經論證 toll樣受體4(Toll like receptor4,TLR4)在巨噬細胞的脂質累積及炎癥反應過程中起重要作用。TLR4

2、首度被發(fā)現(xiàn)是通過識別脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)和活化包含 Src激酶的下游信號,在固有免疫發(fā)揮了重要的作用。作為一種非受體酪氨酸激酶,Src被認為和多種信號通路和細胞過程有關。作為多種內源性、外源性刺激的“整合因子”,調控巨噬細胞的生長,遷移,黏附,及脂質代謝過程。本研究中,通過利用oxLDL刺激巨噬細胞體外模擬動脈粥樣硬化過程,探討TLR4-Src信號傳導通路在oxLDL誘導的巨噬細胞吞脂及炎癥過程中所發(fā)

3、揮的調控作用。
  【方法】
 ?。?)收集人粥樣硬化病變的股動脈以及作為正常對照的乳內動脈標本,提取組織蛋白,用western-blot檢測組織樣品中Src激活情況。
  (2)體外培養(yǎng)人原代巨噬細胞及Raw264.7巨噬細胞系,給予oxLDL刺激誘導,,研究人動脈粥樣硬化斑塊組織中Src激活的增加與oxLDL的關系。
 ?。?)分別使用Src特異性siRNA轉染,及PP2(10μM)或 PP3(10μM)預處

4、理Raw264.7細胞30分鐘后(PP3作為PP2的陰性對照),再加入oxLDL(50ug/mL)刺激細胞24小時。通過分別抑制Src蛋白表達或者激活以觀察Src對于巨噬細胞脂質累積的影響。
 ?。?)導入Src siRNA或TLR4 siRNA以敲減巨噬細胞TLR4或者Src蛋白表達水平,用oxLDL(50ug/ml)刺激細胞24h,檢測細胞內CD36及LOX-1的蛋白表達,檢測TLR4/Src經由哪種受體調控細胞脂質累積。

5、r> ?。?)以上述方抑制Src表達水平和活性之后,使用oxLDL刺激細胞24h,檢測細胞培養(yǎng)液上清中炎癥因子IL6、IL8、MCP-1和MMP-2的含量。
 ?。?)收集人粥樣硬化病變的股動脈以及作為正常對照的乳內動脈標本,HE染色及免疫組化分析,檢測動脈粥樣斑塊組織中 CD68、TLR4、Src表達水平;對動脈粥樣硬化斑塊組織進行免疫熒光染色,檢測動脈粥樣斑塊組織中CD68、TLR4、Src的表達定位。
  (7)TLR

6、4特異性siRNA導入RAW264.7細胞中,并以導入陰性對照(NC)為參照,轉染48小時后 oxLDL(50ug/ml)刺激1小時,檢測Src激活情況。
 ?。?)oxLDL(50ug/ml)刺激Raw264.7細胞0,15,30,60分鐘,采用免疫共沉淀法,檢測TLR4與Src在體外的結合情況。
 ?。?)將TLR4特異性siRNA導入Raw264.7細胞系后,oxLDL(50ug/ml)刺激細胞60分鐘后,通過細胞免疫

7、熒光法,檢測細胞Src、TLR4的表達水平,并進行共定位。
 ?。?0)導入TRAF6 siRNA以降低TRAF6的表達水平48h,oxLDL(50ug/ml)刺激60分鐘,進一步通過免疫共沉淀法,檢測TLR4和Src的結合水平。(11)oxLDL(50ug/ml)刺激巨噬細胞60分鐘,采用免疫共沉淀法檢測TLR4與Fyn及Lyn的結合情況。
  【結果】
  (1)與人動脈正常組織相比較,粥樣硬化病變組織中Src激活

8、顯著性增加。
 ?。?)oxLDL刺激巨噬細胞后,Src的表達活性增加,并呈時間和劑量依賴性。
 ?。?)抑制了Src表達和激活后,oxLDL所誘導的巨噬細胞的吞脂反應顯著下降。
 ?。?)抑制細胞內Src及TLR4表達水平后,oxLDL誘導的CD36表達水平下降。
 ?。?)抑制細胞內Src表達水平及活性后,炎癥因子IL6、IL8、MCP-1和MMP-2的分泌量下降。
 ?。?)相較于正常乳內動脈組織,發(fā)

9、生動脈粥樣硬化病變的股動脈組織中,巨噬細胞(CD68陽性細胞)高富集于動脈粥樣硬化斑塊脂核區(qū),且巨噬細胞中TLR4表達量及Src激酶酪氨酸418位點活化均升高,免疫熒光結果示Src與TLR4共定位于CD68陽性細胞中。
 ?。?)與oxLDL(-)組相比,oxLDL刺激巨噬細胞后,其Src激酶磷酸化顯著升高,結果具有統(tǒng)計學差異(**P<0.01)。當TLR4表達下調時(TLR4特異性siRNA組),oxLDL誘導Src激酶磷酸化能

10、力顯著性受到抑制,結果具有統(tǒng)計學差異(## P<0.01)。
 ?。?)oxLDL刺激Raw264.7細胞30和60分鐘組,TLR4和Src能夠相互作用并結合在一起。
 ?。?)oxLDL刺激后,細胞膜表面可見紅色TLR4及綠色Src免疫染色,證實細胞膜表面有TLR4及Src表達。融合照片可見,TLR4和Src共定位于RAW264.7細胞膜表面,黃色區(qū)域為融合區(qū)域。且TLR4特異性siRNA處理組,可見其Src表達水平明顯下

11、降。
  (10)TRAF6敲減后,TLR4與Src結合無明顯變化。
 ?。?1)oxLDL(50ug/ml)刺激巨噬細胞60分鐘后,Src家族成員Fyn及Lyn未見與TLR4結合
  【結論】
  oxLDL通過TLR4介導,誘導Src表達激活升高,并促進TLR4/Src復合體形成,調控巨噬細胞內脂質累積及炎癥反應過程,從而參與到動脈粥樣硬化的進程中。而此過程與巨噬細胞膜表面清道夫受體CD36表達水平有關,但不

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