GSK-3β介導(dǎo)地塞米松誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡的體外研究.pdf

1、目的：應(yīng)用地塞米松（DEX）誘導(dǎo)的大鼠胰島INS-1細(xì)胞凋亡模型。探討糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡過程中的作用及可能的分子機制，為進一步闡明類固醇性糖尿病的發(fā)生機制提供實驗依據(jù)。
　　方法：1選用大鼠胰島β細(xì)胞株INS-1細(xì)胞作為研究對象，首先應(yīng)用MTT法檢測不同濃度（0、0.01、0.1、1μM）DEX作用細(xì)胞1，2，3d時細(xì)胞增殖情況，確定DEX的最佳作用濃度和作用時間；2不同濃度DEX作用

2、INS-1細(xì)胞48h后通過臺盼藍(lán)染色、Tunel染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞死亡情況；3免疫熒光染色方法觀察DEX誘導(dǎo)后，INS-1細(xì)胞中GSK-3β和p-GSK-3β(Ser9)的蛋白表達；40.1μM DEX處理 INS-1細(xì)胞48h后，采用 Real-time PCR方法檢測 SOD、iNOS、Nox4、NADPH oxidase(p47phox)和GSK-3βmRNA的表達；采用 western-blot方法檢測GSK-3β、p-G

3、SK-3β(Ser9)、SOD、iNOS和Nox4蛋白的表達；采用ROS試劑盒、Griess法檢測ROS及NO的釋放水平。5觀察加入GSK-3β抑制劑LiCl后上述各項指標(biāo)變化。
　　結(jié)果：DEX（0、0.01、0.1、1μM）作用INS-1細(xì)胞1--3天，隨著DEX劑量和時間增加，INS-1細(xì)胞存活率下降；Tunel染色、流式細(xì)胞術(shù)證實0.1μΜ濃度的DEX作用INS-1細(xì)胞48h時，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象，并且與對照組相比，細(xì)

4、胞培養(yǎng)上清中的ROS、NO水平升高，Nox4、p47phox、iNOS mRNA表達上調(diào)，SOD mRNA表達下調(diào)；iNOS、Nox4蛋白表達水平升高，SOD、p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達明顯降低，總GSK-3β蛋白表達無明顯變化。加入LiCl后DEX誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率明顯下降，ROS、NO水平降低，Nox4、p47phox、iNOS mRNA表達及iNOS、Nox4蛋白表達均明顯下調(diào)，p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達上調(diào)，差