殼寡糖調節(jié)巨噬細胞自噬抑制泡沫化作用機制研究.pdf

1、目的：動脈粥樣硬化(AS)是一種進行性多病灶的脈管系統(tǒng)炎癥性疾病，與高血脂、高血壓、糖尿病以及肥胖等疾病具有密切聯(lián)系，對全身各個重要組織器官均有影響。隨著動脈粥樣硬化不斷發(fā)展，血管內壁脂質堆積、炎性反應和血管壁異常重建逐漸增多，使血管內膜增生形成斑塊;在動脈粥樣硬化后期，這些斑塊非常不穩(wěn)定，容易破裂并脫落形成動脈血栓，這是導致急性心血管事件的主要原因。動脈粥樣硬化斑塊形成是一個復雜的過程，其影響因素眾多，脂質和膽固醇代謝異常對于促進動脈

2、粥樣硬化斑塊形成發(fā)揮了重要作用。巨噬細胞吞噬大量脂質形成的泡沫細胞是動脈粥樣硬化斑塊中的主要成分，同時也是導致斑塊不穩(wěn)定的關鍵因素。增強巨噬細胞自噬，促進RAW264.7巨噬細胞中膽固醇外排、抑制ox-LDL攝取對于抑制泡沫細胞形成，減緩動脈粥樣硬化斑塊形成和減少粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性具有十分重要的意義。殼寡糖是一類天然堿性多糖，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有多種生物活性，包括抗炎、抗腫瘤、抗病毒以及抗阿爾茲海默病等。本研究主要為了考察殼寡糖對巨噬細

3、胞泡沫化和自噬的調控作用及其可能的作用機制。
　　方法：采用的是氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導的巨噬細胞源泡沫細胞模型，通過油紅O染色、總膽固醇含量測定評價殼寡糖對巨噬細胞內脂質堆積的影響;采用熒光標記氧化型低密度脂蛋白(Dil-LDL)和25-NBD膽固醇檢測巨噬細胞ox-LDL攝取和膽固醇外流水平;使用Western blot技術來檢測膽固醇流入和流出相關蛋白(ABCA1、ABCG1、SR-A、CD36)以及自噬相關蛋白

4、(LC3Ⅱ/Ⅰ、P62)的表達水平，觀察殼寡糖對RAW264.7巨噬細胞自噬和泡沫化的影響;最后對自噬上游關鍵分子mTOR進行特異性干擾，通過Western blot技術檢測p-mTOR、mTOR、LC3、p62等蛋白表達并且進行定量分析，探討殼寡糖調控巨噬細胞自噬可能的機制;最后通過油O染色技術和總膽固醇檢測試劑盒觀察自噬抑制劑3-MA對RAW264.7巨噬細胞泡沫化的影響，進一步研究殼寡糖調控巨噬細胞自噬與殼寡糖調控巨噬細胞內脂質堆

5、積和泡沫化的作用之間的關系。
　　結果：200μg/ml的殼寡糖可以顯著抑制氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導的RAW264.7巨噬細胞內脂質堆積，降低細胞內膽固醇水平;殼寡糖顯著調節(jié)RAW264.7巨噬細胞中與膽固醇外排和吸收關鍵蛋白表達，抑制RAW264.7巨噬細胞脂質堆積和泡沫化。200μg/ml殼寡糖處理RAW264.7巨噬細胞12h后明顯上調細胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平同時顯著下調P62水平，殼寡糖明顯提高RAW264

6、.7巨噬細胞中自噬活性。在探究殼寡糖促進RAW264.7巨噬細胞自噬可能的分子機制時采用相應的化合物干擾細胞自噬以及mTOR的表達，實驗的結果表明，選擇氯喹可以顯著降低殼寡糖促進RAW64.7巨噬細胞自噬的作用，這是由于氯喹作為自噬抑制劑可以特異性抑制細胞內晚期自噬;亮氨酸作為自噬抑制劑可以促進mTOR的表達，在使用殼寡糖處理RAW264.7巨噬細胞的同時使用亮氨酸后檢測到mTOR磷酸化水平升高，并且殼寡糖上調RAW264.7巨噬細胞自