唐魚(yú)三個(gè)分子伴侶基因的克隆及重金屬對(duì)其mRNA表達(dá)的影響.pdf

1、本文以唐魚(yú)（Tanichthys albonubes）為研究對(duì)象，開(kāi)展了其熱休克蛋白(Heat shock protein， HSP)基因家族HSP60、HSP70以及HSP90三個(gè)成員的克隆，組織表達(dá)以及不同濃度的重金屬（銅和鎘）暴露下的表達(dá)等研究工作。結(jié)果如下：
　　 1.HSP60、HSP70和HSP90基因cDNA全長(zhǎng)的克隆與分析采用同源克隆和RACE技術(shù)分別克隆了這三個(gè)熱休克蛋白基因cDNA全長(zhǎng)序列，TaHSP60（G

2、enbank登錄號(hào)：HM234132）序列全長(zhǎng)2486bp，編碼一個(gè)由575個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，具有典型的mt-HSP60特征序列，ATP結(jié)合位點(diǎn)，以及C-末端保守的重復(fù)區(qū)域GGM。TaHSP70（Genbank登錄號(hào)：HQ007352）序列全長(zhǎng)2398bp，編碼一個(gè)由643個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，具有3個(gè)HSP70家族簽名序列（IDLGTTYS、IFDLGGGTFDVSIL和VLVGGSTRIPKIQK）以及C-末端胞質(zhì)HSP

3、70特征基序EEVD。TaHSP90（Genbank登錄號(hào)：HM234131）序列全長(zhǎng)2686bp，編碼一個(gè)由726個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，具有5個(gè)高度保守的HSP90簽名序列(NKEIFLRELISNA[S/A]DALDKIR、LGTIA[K/R]SGT、IGQFGVGFYSA[Y/F]LVA[E/D]、IKLYVRRVFI和GVVDS[E/D]DLPLN[IN]SRE)以及C-末端胞質(zhì)HSP90特有的基序MEEVD。
　　

4、 2.HSP60、HSP70和HSP90的組織表達(dá)分析通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了三個(gè)熱休克蛋白基因在唐魚(yú)成魚(yú)肝臟、肌肉、鰓、鰭條、眼睛、卵巢、腸道和腦中的表達(dá)情況。研究結(jié)果顯示，HSP60基因mRNA在肝臟中的表達(dá)量最高，其次是肌肉組織（約為肝臟的0.67倍，P＜0.05），而鰓中HSP60的表達(dá)量最低（約為肝臟的0.04倍，P＜0.05），鰭條中HSP60的表達(dá)量為肝臟的0.041倍（P＜0.05），腸道、眼睛、卵巢、肌肉和腦中HS

5、P60mRNA表達(dá)量分別為肝臟的0.45、0.18、0.10、0.67和0.05倍(P＜0.05);HSP70基因mRNA在肝臟中的表達(dá)量最高，肌肉組織中mRNA的表達(dá)量與肝臟相比無(wú)顯著差異，其它各組織與肝臟相比均有顯著差異(P＜0.05)，其中眼睛中的HSP70表達(dá)量最低（約為肝臟的0.38倍），腸道、鰓、鰭條、卵巢和腦中HSP70mRNA的表達(dá)量分別為肝臟的0.60、0.58、0.49、0.42和0.39倍；HSP90基因mRNA在

6、肝臟中的表達(dá)量最高，肌肉（約為肝臟的0.98倍）和鰓（約為肝臟的0.85倍）中mRNA的表達(dá)平與肝臟相比無(wú)顯著差異，其它各組織與肝臟相比均有顯著差異（P＜0.05），卵巢中的HSP90表達(dá)量最低（約為肝臟的0.40倍），鰭條、眼睛、腸道和腦中HSP90mRNA的表達(dá)量分別為肝臟的0.70、0.49、0.70和0.47倍。
　　 3.重金屬暴露對(duì)HSP60、HSP70和HSP90 mRNA表達(dá)量的影響利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了重

7、金屬銅和鎘暴露后HSP60、HSP70和HSP90 mRNA表達(dá)量的變化。結(jié)果表明，不同的熱休克蛋白對(duì)銅和鎘的反應(yīng)是不一樣的，甚至即使是同一家族的熱休克蛋白在同一生物體的不同組織中表達(dá)也是有差別的。唐魚(yú)暴露于銅和鎘中96h均可誘導(dǎo)HSP60 mRNA的表達(dá)量顯著增加(P＜0.05)，且銅對(duì)HSP60的誘導(dǎo)強(qiáng)度明顯高于鎘的誘導(dǎo)強(qiáng)度。13.50μg/L的銅暴露下，唐魚(yú)肝臟和鰓中HSP70 mRNA的表達(dá)量無(wú)顯著變化；27.00μg/L的銅暴

8、露下，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，96h內(nèi)唐魚(yú)肝臟和鰓中該基因的表達(dá)量呈上調(diào)趨勢(shì)。1.15mg/L的鎘暴露下，肝臟96h內(nèi)HSP70 mRNA的表達(dá)量無(wú)顯著變化，而鰓中HSP70 mRNA的表達(dá)量72h顯著上調(diào)至峰值（P＜0.05）；2.31mg/L的鎘暴露下，肝臟和鰓中HSP70 mRNA的表達(dá)量顯著上調(diào)至峰值（P＜0.05）后呈下降趨勢(shì)，96h表達(dá)量顯著低于對(duì)照組水平（P＜0.05）。HSP90的表達(dá)水平在銅和鎘暴露后也所不同;在肝臟和鰓兩