PARP-1在苯并芘誘發(fā)細胞惡性轉(zhuǎn)化表遺傳改變中的作用.pdf

1、研究背景：近年來，表觀遺傳學(xué)(epigenetics)已成為生命科學(xué)中普遍關(guān)注的前沿學(xué)科。表觀遺傳學(xué)是與遺傳學(xué)(genetics)相對應(yīng)的概念。在人類基因組中含有兩類信息：一類是傳統(tǒng)意義上的遺傳學(xué)信息，它提供了合成生命所必需的所有蛋白質(zhì)的模板；另一類是表觀遺傳學(xué)信息，它提供了何時、何地及如何應(yīng)用遺傳學(xué)信息的指令，以確?；蜻m當(dāng)?shù)亻_關(guān)。遺傳學(xué)是指基于基因序列改變所致基因表達水平變化，如基因突變、基因雜合丟失和微衛(wèi)星不穩(wěn)定等；而表觀遺傳學(xué)則

2、是指基于非基因序列改變所致基因表達水平變化。表觀遺傳學(xué)研究主要涉及DNA甲基化、組蛋白翻譯后修飾、染色質(zhì)重塑以及MicroRNA、SiRNA等。大量研究表明表觀遺傳學(xué)異常與人類多種疾病密切相關(guān)，尤其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，表觀遺傳學(xué)改變更是起重要作用。多聚腺苷二磷酸核糖基聚合酶-1(poly(ADP-ribose)polymerase-1，PARP-1)是較早認識到的DNA損傷感應(yīng)及監(jiān)測分子，是最早發(fā)現(xiàn)的PARP超家族成員，也是至今研究

3、得最多的一個。它廣泛存在于真核細胞中，是一類重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾酶，負責(zé)細胞內(nèi)90％的聚ADP-核糖基聚合體合成。從PARP-1發(fā)現(xiàn)至今的短短四十余年中，該酶一直是分子生物學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的熱點之一。隨著研究的不斷深入，已經(jīng)證明，PARP參與許多重要的生命活動如凋亡、轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)、細胞死亡、染色體功能、基因組完整性和DNA甲基化等，PARP-1抑制劑在糖尿病、急慢性炎癥、出血性休克及心臟、腎、腸的缺血再灌注損傷等的治療中也發(fā)揮重要作用。

4、
　　 目的：應(yīng)用RNA干擾技術(shù)建立人支氣管上皮細胞16HBE的PARP-1基因缺陷細胞株，動態(tài)觀察BaP誘發(fā)人支氣管上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的表觀遺傳改變，并探討PARP-1在表觀遺傳改變中的作用，為闡明PARP-1參與BaP引起表觀遺傳改變的分子機制和尋找BaP致癌過程中早期敏感的生物標(biāo)志物提供理論依據(jù)，為化學(xué)致癌的防治提供新的思路。
　　 方法：
　　 ⑴應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)構(gòu)建人支氣管上皮細胞(1

5、6HBE)的PARP-1缺陷細胞株(16HBE-shPARP1)，作為本研究的工具細胞；同時比較兩種細胞的一般生物學(xué)特性(包括生長狀況、細胞形態(tài)學(xué)和細胞周期等)。
　　 ⑵分別以1.0、2.0、5.0、10.0、15.0和30.0μmol/L的BaP處理16HBE和16HBE-shPARP1細胞12h和24h，用單細胞凝膠電泳實驗檢測兩種細胞的DNA損傷程度；再將BaP處理24h后的兩組細胞分別恢復(fù)培養(yǎng)12h和24h，用單細胞凝

6、膠電泳實驗檢測其損傷DNA恢復(fù)情況。
　　 ⑶分別以1.0、2.0、5.0、10.0、15.0和30.0μmol/L BaP處理16HBE和16HBE-shPARP1細胞72h，以5-甲基胞嘧啶細胞免疫熒光和高效毛細管電泳法檢測各處理組細胞基因組DNA整體甲基化水平；同時以基于ELISA樣反應(yīng)和生物素標(biāo)記底物NAD+法檢測胞內(nèi)總體甲基轉(zhuǎn)移酶和PARP酶活性，并以RT-Q-PCR和Western Blotting檢測PARP-1和

7、甲基化相關(guān)酶的mRNA和蛋白表達水平。
　　 ⑷以40.0μmol/L BaP誘導(dǎo)處理16HBE細胞24h，隨后換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)、傳代，每周誘導(dǎo)處理一次；每隔三周取細胞做軟瓊脂克隆形成實驗和裸鼠皮下成瘤實驗，鑒定細胞的惡性程度，最終以BaP誘導(dǎo)18周后惡性轉(zhuǎn)化的16HBE細胞為誘導(dǎo)終點，簡稱為BTC。
　　 ⑸以RT-Q-PCR和Western Blotting分別檢測BaP誘導(dǎo)16HBE細胞惡性轉(zhuǎn)化各階段細胞PARP-

8、1和腫瘤相關(guān)基因p53及k-ras的mRNA和蛋白表達水平；在亞硫酸氫鹽修飾基因組DNA的基礎(chǔ)上，以MSP檢測上述各基因啟動子區(qū)特異位點的甲基化狀況；同時對各階段細胞的PARP-1和p53啟動子區(qū)的CpG島進行克隆測序，全面觀察目的基因啟動子區(qū)甲基化修飾狀況。
　　 ⑹以細胞免疫熒光法檢測各階段細胞組蛋白H3、H4整體乙酰化水平；同時以基于ELISA樣反應(yīng)檢測胞內(nèi)總體組蛋白去乙?；傅幕钚?，并RT-Q-PCR和Western B

9、lotting檢測組蛋白去乙?；傅膍RNA和蛋白表達水平。
　　 結(jié)果：
　　 ①16HBE和16HBE-shPARP1細胞經(jīng)BaP染毒處理后，其DNA損傷的程度均呈劑量、時間依賴性加??；對兩種細胞進行平行比較發(fā)現(xiàn)，染毒劑量和染毒時間一定時，16HBE-shPARP1細胞的各損傷指標(biāo)均明顯高于16HBE細胞，PARP-1基因的沉默可加重BaP引起的16HBE細胞DNA損傷程度。
　　 ②利用5mdC抗體進行細胞

10、免疫熒光實驗，從形態(tài)學(xué)上觀察細胞基因組DNA甲基化的定位并比較各處理組之間平均熒光強度的變化趨勢。結(jié)果顯示，與16HBE細胞相比，16HBE-shPARP1細胞的平均熒光強度明顯增高。兩種細胞經(jīng)BaP染毒處理72h后，隨著染毒劑量的增加，各處理組細胞的平均熒光強度值均呈略增高后逐漸降低的趨勢；當(dāng)染毒劑量為30.0μmol/L時，16HBE和16HBE-shPARP1細胞的平均熒光強度值顯著降低。
　　 ③16HBE及16HBE-

11、shPARP1細胞經(jīng)BaP處理72h后，隨著BaP染毒劑量的增加，兩種細胞胞內(nèi)PARP酶活性及PARP-1的mRNA、蛋白表達水平均呈現(xiàn)先增高后降低的一致趨勢，16HBE-shPARP1細胞各處理組普遍顯著低于16HBE細胞組。于最高染毒劑量組30.0μmol/L時，兩種細胞的PARP-1表達水平下降顯著。
　　 ④5mdC甲基化免疫熒光實驗結(jié)果顯示，在BaP誘導(dǎo)16HBE細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中，與正常16HBE細胞相比，隨著BaP

12、誘導(dǎo)時間的延長，各階段細胞基因組DNA整體甲基化水平逐漸降低。用HPCE進一步進行定量檢測發(fā)現(xiàn)，正常16HBE細胞中平均mCpG％值約為4.78％，隨著BaP誘導(dǎo)時間的延長，六個階段細胞的mCpG％值分別為4.62±0.39％、3.82±0.39％、4.07±0.40％、3.27±0.31％、2.63±0.21％和2.48±0.15％；BTC細胞經(jīng)DAC處理72h后，其mCpG％值進一步下降為2.11±0.09％。
　　 ⑤16

13、HBE細胞經(jīng)BaP誘導(dǎo)惡性轉(zhuǎn)化過程中，隨著BaP誘導(dǎo)處理時間的延長，16HBE細胞中PARP-1的mRNA和蛋白表達水平均逐漸增高，并在BTC細胞中表達水平達到最高。對癌基因k-ras和抑癌基因p53進行表達檢測發(fā)現(xiàn)，隨著16HBE細胞惡性程度的增加，k-ras表達逐漸增高，其中，BTC細胞中k-ras基因的表達量為正常對照組16HBE細胞的8倍以上；而p53的表達水平則呈逐漸降低的趨勢，并于BTC細胞中降低最顯著。
　　 ⑥細

14、胞免疫熒光實驗顯示，隨著BaP誘導(dǎo)時間的延長，與正常對照組16HBE細胞相比，誘導(dǎo)各階段細胞的組蛋白H3、H4整體乙?；骄手饾u降低的趨勢，而組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA處理可抑制BTC細胞組蛋白H3、H4乙?；降慕档挖厔荨＠肊LISA樣反應(yīng)對胞內(nèi)總體組蛋白去乙?；傅幕钚赃M行檢測發(fā)現(xiàn)，隨著誘導(dǎo)時間的延長，各階段細胞中總體組蛋白去乙酰化酶活性呈逐漸升高的趨勢；具體來看，與正常對照組16HBE細胞相比，六階段細胞中HDACs活性

15、分別增高了18.3％、35.0％、49.6％、53.3％、54.8％和83.6％。采用RT-Q-PCR和Western Blotting對HDACs表達水平進行檢測發(fā)現(xiàn)，隨著BaP誘導(dǎo)處理時間的延長，HDAC-1和HDAC-2的mRNA和蛋白表達水平均逐漸增高，并于BTC細胞中增高顯著；TSA處理均能降低BTC細胞中HDAC-1和HDAC-2的表達水平。HDAC-3在各階段細胞中的表達水平變化并不明顯。
　　 結(jié)論：
　　

16、 ⑴利用慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)成功構(gòu)建人支氣管上皮細胞的PARP-1基因缺陷細胞株，沉默效果顯著且穩(wěn)定性好，為后續(xù)PARP-1基因功能研究提供了有效的工具細胞。
　　 ⑵PARP-1缺陷可增加16HBE細胞對BaP的敏感性，PARP-1對BaP引起16HBE細胞DNA損傷的早期修復(fù)至關(guān)重要。
　　 ⑶PARP-1對胞內(nèi)DNMT-1的活性具有抑制效應(yīng)，且這種效應(yīng)隨著PARP-1的缺失而緩解；PARP-1所催化的ADP核

17、糖基化反應(yīng)可通過抑制DNMT-1的酶活性來調(diào)節(jié)BaP誘導(dǎo)的16HBE細胞DNA甲基化水平改變。
　　 ⑷BaP誘發(fā)16HBE細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中，基因組DNA整體甲基化水平逐漸降低，使得基因組的不穩(wěn)定性增強，這是引發(fā)多種遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變的積累，是最終導(dǎo)致細胞惡性轉(zhuǎn)化的早期驅(qū)動力。
　　 ⑸BaP誘發(fā)16HBE細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中，PARP-1和癌基因k-ras表達顯著上調(diào)，抑癌基因p53表達下調(diào)，這些改變均不受基因啟動