Glut--1在喉癌Hep--2細胞生長、遷移、化療抵抗中的作用及機制研究.pdf

1、背景和目的：
　　喉鱗狀細胞癌(Laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC)是頭頸部發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，也是第二大呼吸道高發(fā)癌。LSCC一般按照腫瘤大小(Tumor size，T)、頸部淋巴結轉移(Cervical lymph node metastasis，N)及遠處轉移(Distantmetastasis，M)對其分期。原位癌的淋巴轉移直接影響其治療方式、患者生存期，研究報道，LSCC頸

2、部淋巴結轉移率分別約為:T16-25％、T230-70％、T3及T465％-80％。一般LSCC預后不良的因素包括T、N分級升高及出現(xiàn)遠處轉移等。然而，對于喉鱗狀細胞癌臨床預后影響因素的相關文獻報道尚不一致。因此，本研究第一部分旨在研究不同臨床病理因素對LSCC預后的影響。
　　葡萄糖是腫瘤細胞增殖、分化、侵襲及轉移的主要能量來源，細胞對葡萄糖攝取主要依賴葡萄糖轉運蛋白(glucosetransporter，Glut)，其中Glu

3、t-1是細胞攝取葡萄糖的主要載體。與正常細胞相比，腫瘤細胞自身更偏好于在厭氧環(huán)境中利用糖酵解途徑產(chǎn)生能量，為適應腫瘤微環(huán)境，大多數(shù)惡性腫瘤細胞都高表達Glut-1以滿足其能量的需要，因此，Glut-1作為惡性腫瘤基因治療的重要靶點成為近年來腫瘤研究領域的熱點。Glut-1與腫瘤細胞生長、遷移有著密切的關系。大量研究報道，抑制腫瘤細胞Glut-1的表達能有效抑制惡性腫瘤細胞增殖、遷移、誘導細胞周期阻滯及凋亡。然而，Gult-1抑制對喉癌細

4、胞生長及遷移的影響及其分子機制卻很少被報道。因此，本研究第二部分旨在探討Gult-1敲低對喉癌Hep-2細胞增殖、凋亡、遷移的影響，并通過研究相關信號通路蛋白及基因的表達探討其分子機制。
　　自噬在腫瘤細胞生長、遷移中起著重要的作用，是一種真核細胞對損壞的蛋白或細胞器進行降解并循環(huán)利用的過程，在腫瘤細胞生長、遷移過程中扮演著促細胞存活與誘導細胞死亡的雙重角色。一定程度的自噬促進腫瘤的生長、侵襲，而過度持續(xù)的自噬可激活腫瘤細胞自我降

5、解從而導致細胞死亡。自噬相關蛋白Beclin1是細胞發(fā)生自噬的重要標志物之一，在誘導自噬開始階段起著重要作用。研究證明調節(jié)惡性腫瘤細胞Glut-1基因及蛋白的表達可以通過影響細胞自噬通路來調節(jié)細胞生長、遷移。然而，Gult-1對喉癌自噬的影響及其機制尚缺乏相關文獻支撐。因此，探索敲低Gult-1及調節(jié)Beclin1表達在喉癌Hep-2細胞自噬中的作用及其對細胞生長、遷移的回復效應成為本研究的主要目的之一。
　　腫瘤生長的微環(huán)境在腫

6、瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療抵抗、復發(fā)中具有重要作用，尤其乏氧微環(huán)境和腫瘤治療抵抗、復發(fā)關系密切。實體瘤內(nèi)部乏氧微環(huán)境下誘導的新生血管形成、對葡萄糖的攝取和代謝增加是腫瘤對放、化療抵抗的重要原因。在乏氧的情況下HIF-1α表達急劇升高，激活Glut-1中mRNA過度表達及其產(chǎn)物的大量合成，以便轉運更多的葡萄糖以滿足惡性腫瘤細胞高代謝率和快速生長的需要，阻斷其中的某些重要環(huán)節(jié)對消除腫瘤治療抵抗與復發(fā)具有重要作用。而目前Glut-1與喉癌化療耐藥關

7、系的研究少見。因此，本研究第四部分旨在了解喉癌Hep-2細胞中Glut-1蛋白表達與腫瘤耐藥的關系，并通過RNA干擾阻斷喉癌Hep-2細胞Glut-1的表達，闡明Glut-1表達改變影響喉癌Hep-2細胞能量供應及提高喉癌Hep-2細胞化療敏感性的可能機制。
　　方法：
　　1.回顧性研究2013年1月-2013年12月71例我院首次治療的喉鱗狀細胞癌患者，分析不同性別、年齡、TNM分期、臨床分期、腫瘤位置、病理分化程度、治

8、療方式等因素對患者預后的影響。
　　2.采用短發(fā)夾RNA（Short hairpin RNA，shRNA）抑制喉癌Hep-2細胞Glut-1蛋白及基因的表達，觀察對細胞增殖、凋亡及遷移的影響，并研究其抑制細胞增殖及遷移、促進細胞凋亡的機制。
　　3.通過雷帕霉素或高表達Beclin1從而促進細胞自噬，研究Glut-1敲低+促進自噬對Hep-2細胞增殖、凋亡及遷移的影響，通過敲低Beclin1從而抑制細胞自噬，研究Glut-1

9、敲低+抑制自噬對Hep-2細胞增殖、凋亡及遷移的影響。以此探討Glut-1在喉癌細胞自噬中的作用及其對細胞生長及遷移的回復效應。
　　4.篩選針對Hep-2細胞有效的Glut-1干擾片段siRNA以及對Hep-2細胞功能影響有效的順鉑濃度;通過RNA干擾抑制Glut-1表達對Hep-2細胞順鉑敏感性的影響，研究Glut-1表達改變影響Hep-2細胞化療敏感性的可能機制。
　　結果：
　　1.單因素生存分析顯示年齡、T分

10、期、鱗狀細胞癌的分化程度、治療方式對喉鱗狀細胞癌患者的生存率影響較小(P＞0.05)，聲門上型患者的死亡率顯著高于聲門型患者(P＜0.05)，提示聲門上型喉鱗狀細胞癌的預后較聲門型差;無淋巴結轉移的患者其生存率顯著高于有淋巴結轉移的患者，提示有淋巴結轉移的喉鱗狀細胞癌其預后較差(P＜0.01);臨床分期越高，患者死亡率越高，提示喉鱗狀細胞癌臨床分期越高預后越差（P=0.000）。COX比例風險模型回歸分析顯示，僅年齡、治療方式兩個變量對

11、患者預后的影響有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2.Glut-1敲低顯著抑制細胞周期相關蛋白cyclinD1(27％)及細胞增殖相關蛋白c-myc(29％)的表達，從而抑制Hep-2的增殖活性（24h、48h、72h分別約為NC組的87.4％、73.2％、55.8％）;Glut-1敲低通過抑制抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白及基因的表達（約23.2％），促進促凋亡相關的激活的Caspase3蛋白及基因的表達(2.45倍)，從而促進H

12、ep-2細胞發(fā)生凋亡（Glut-1 shRNA、Control、NC組細胞凋亡率分別約為25.9％、3.2％及3.1％）;Glut-1敲低通過上調抑制細胞遷移相關蛋白E-cadherin的表達（約2.1倍），下調促細胞遷移相關蛋白N-cadherin蛋白及基因的表達（約降低45％），從而抑制喉癌細胞遷移（約降低57.6％）。
　　3.Gult-1敲低能促進細胞自噬，自噬誘導劑雷帕霉素及高表達Beclin1能顯著誘導細胞發(fā)生自噬，自

13、噬誘導能進一步促進Gult-1敲低細胞的自噬水平;在Gult-1敲低的基礎上，過度誘導自噬會進一步降低細胞增殖相關cyclinD1與c-myc蛋白的表達，進一步降低細胞存活率。在Gult-1敲低的基礎上，誘導自噬能進一步下調Hep-2細胞抗凋亡相關Bcl-2，上調促凋亡相關蛋白cleaved-caspase3的表達，從而進一步促進細胞發(fā)生凋亡。在Gult-1敲低的基礎上誘導自噬，能促進抑制細胞遷移E-cadherin蛋白及基因的表達，而

14、抑制促細胞遷移N-cadherin蛋白及基因的表達，從而進一步抑制Hep-2細胞的遷移。反之，敲低Beclin1能顯著抑制細胞自噬，能有效逆轉Gult-1敲低引起的細胞自噬水平的升高，能逆轉Gult-1敲低引起的細胞增殖活性降低，上調細胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，有效逆轉Gult-1敲低誘導的細胞凋亡，自噬抑制能有效逆轉Gult-1敲低誘導的細胞遷移能力降低的效應。
　　4.在4組RNA干擾抑制Hep-2細胞Gult-1表達組中

15、，siRNA726組的抑制效果最佳，并同時對MRP1基因產(chǎn)生抑制;在3種不同順鉑濃度對喉癌Hep-2細胞功能影響中，3μg/mL的順鉑濃度對Hep-2細胞抑制增殖、促進凋亡作用效果最好;Hep-2細胞RNA干擾抑制Glut-1表達后可以抑制MRP1基因及蛋白的表達，順鉑可以上調Hep-2細胞RNA干擾抑制Glut-1表達后MRP1基因及蛋白的表達，且RNA干擾抑制Glut-1對MRP1基因及蛋白的抑制作用大于順鉑的促進作用。
　　

16、結論：
　　1.年齡、N分期、臨床分期、腫瘤位置、治療方式等因素可能對喉鱗狀細胞癌患者的預后有一定影響。
　　2.Gult-1的敲低能抑制Hep-2細胞的增殖;促進Hep-2細胞發(fā)生凋亡;抑制Hep-2細胞遷移。
　　3.shRNAGlut-1及誘導自噬可以影響喉癌Hep-2細胞生長、遷移;shRNA Glut-1可以通過影響自噬調節(jié)喉癌Hep-2細胞生長、遷移。
　　4.RNA干擾抑制Glut-1后可以抑制MR