表面等離子體共振生物傳感器的構(gòu)建及其在病原微生物快速檢測應(yīng)用中的研究.pdf

1、背景：
　　 臨床上，感染性疾病是導(dǎo)致患者死亡的最主要原因之一。大量數(shù)據(jù)表明：近年來，隨著抗生素的濫用不僅加重了患者的負擔(dān)，而且導(dǎo)致了越來越多的耐藥菌株的產(chǎn)生，如VESA、MRSA，加大了疾病治療難度，抗腫瘤藥物、免疫抑制劑等藥物的使用以及人群老齡化和免疫力低下人群的出現(xiàn)，使感染性疾病發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。創(chuàng)傷感染及其并發(fā)癥已成為患者死亡與傷殘的重要原因之一。而且全球日益惡化的自然環(huán)境和生態(tài)環(huán)境條件下所產(chǎn)生的新型疾病、愈演愈烈

2、的人獸共患疾病等烈性傳染病都使病原微生物的快速檢驗顯得更加重要。因此，早期、準(zhǔn)確對致病病原微生物進行診斷是確保提供有效治療方案，提高患者預(yù)后，進一步降低其死亡率的最有效方法。快速檢測技術(shù)及小巧便攜式設(shè)備的研制將極大地豐富現(xiàn)有的檢測手段，促進醫(yī)學(xué)實驗診斷水平的提高，贏得患者救治的時間，解決臨床上急需解決的問題，從而最大限度地降低傷亡率，提高我國的醫(yī)學(xué)實驗診斷能力。這在當(dāng)今全球大的自然災(zāi)害時有發(fā)生的情況以及新的公共衛(wèi)生形勢下尤其具有重要的意

3、義。
　　 傳統(tǒng)的病原微生物的檢測和鑒定主要是使用分離培養(yǎng)結(jié)合形態(tài)特性、生化鑒定、免疫分析的方法，存在操作復(fù)雜、特異性不強、所需時間長等缺點，且許多細菌培養(yǎng)要求高，生化特征、抗生素敏感型等表型特征不穩(wěn)定，易受到基因調(diào)控、質(zhì)粒獲失及技術(shù)操作等方面的影響。后期發(fā)展起來的分子生物學(xué)技術(shù)由于其高效、快速的優(yōu)勢迅速在分子診斷領(lǐng)域得到了飛速發(fā)展，其中以PCR 技術(shù)為核心的核酸擴增方法使得微量靶分子的檢測成為可能。但是如何確保PCR 產(chǎn)物的檢

4、測特異性和效率是一個極待解決的技術(shù)難題。電泳技術(shù)簡便快捷，然而其分辨率有限，只能作為定性分析方法。
　　 生物傳感器是較新的一門學(xué)科，然而其一誕生則在實驗室診斷領(lǐng)域獲得了廣泛應(yīng)用。其檢測原理是將生物信號轉(zhuǎn)換為電信號，然后再轉(zhuǎn)換為計算機可以識別的數(shù)字信號的過程。根據(jù)其轉(zhuǎn)換方式的不同，可以將生物傳感器分為電化學(xué)傳感器、石英晶體微天平(QCM)、表面等離子體共振(surface plasmon resonance, SPR)等。其中S

5、PR 生物傳感器，集高效、靈敏、特異、結(jié)構(gòu)小巧、經(jīng)濟實用等優(yōu)點于一身，目前已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。它利用換能器，將待測的生物信號轉(zhuǎn)換為電、聲、光等可檢測的物理信號，從而實現(xiàn)對樣本中靶生物分子的檢測。
　　 本實驗即是在前期研究平臺基礎(chǔ)上，將臨床常見的四種感染致病菌：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌為研究對象，充分利用細菌16S rDNA 序列的分子生物學(xué)特點，分別將生物素信號放大技術(shù)引入SPR

6、 生物傳感器，構(gòu)建新型多通道SPR 技術(shù)監(jiān)測系統(tǒng)，進而建立一種操作簡單、靈敏度高、特異性強的微生物病原菌快速檢測方法，為應(yīng)用于野外、自然災(zāi)害等特殊領(lǐng)域提供堅實的實驗基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.在前期研究基礎(chǔ)上，對SPR 生物傳感器檢測平臺的硬件系統(tǒng)和軟件系統(tǒng)進行改進，增加溫控系統(tǒng)，加強電磁屏蔽，采用UMPHO-A450控制軟件，對傳感器檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性、重復(fù)性進行評價。對芯片自組裝方法進行改進，采用SDS 再生液將親

7、和素修飾的寡核苷酸探針還原后再進行SPR 掃描，探討探針固定影響因素，確定最適反應(yīng)條件。
　　 2.利用Vector NTi9.0軟件套組對目標(biāo)病原菌的16S rDNA 序列進行分析，確定16s rDNA 保守區(qū)域序列和可變區(qū)域序列；利用Primer Premier 5.0軟件，針對16S rDNA保守區(qū)域序列，設(shè)計適用于目標(biāo)病原菌的PCR 擴增通用引物；利用Array Designer 4.0軟件設(shè)計針對各目標(biāo)病原菌16S r

8、DNA 可變區(qū)域序列的特異性寡核苷酸探針。探討雜交反應(yīng)的影響因素，優(yōu)化反應(yīng)體系，初步建立感染常見病原菌SPR 生物傳感器檢測方法。
　　 3.以臨床200例臨床標(biāo)本為檢測對象，采用試劑盒法提取細菌基因組DNA，用于SPR 生物傳感器檢測；并以血培養(yǎng)鑒定法為參照方法，對建立的SPR 生物傳感器微陣列檢測方法進行方法學(xué)比較和評估，確定臨床樣本檢測步驟。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功構(gòu)建適合野外環(huán)境下小型化SPR 生物

9、傳感器檢測儀，檢測儀規(guī)格為8通道串聯(lián)檢測池，進樣臺規(guī)格為4×4孔(1.5ml),4×8孔(0.5ml)，檢測模式為平行檢測，參考點：可根據(jù)需要設(shè)定1-3個參考點，進樣流速范圍為5-378μl/min,流速控制精度為±1μl/min，系統(tǒng)溫度控制范圍為15℃-50℃(室溫25℃)，溫控精度±0.5℃，樣品回收方式為8通道可各自進行樣品回收。檢測系統(tǒng)穩(wěn)定性良好，八通道間基本不存在干擾，達到了檢測系統(tǒng)的要求。
　　 2.利用設(shè)計的通用

10、引物可以一次性完成所有靶細菌16S rDNA 序列的順利擴增，電泳條帶明亮清晰，具有較好的重復(fù)性。自行設(shè)計的探針特異性強、可靠性好，探針間Tm值相差僅為0.5℃，基本上具有相同的雜交條件，可用于傳感器微陣列系統(tǒng)的檢測。檢測最適雜交溫度為45℃，雜交檢測時間為90min。
　　 3.病原菌基因組DNA 試劑盒提取方法結(jié)果顯示，該方法操作簡便、污染機會少，而且效果好，能裂解所研究的所有菌種，PCR 產(chǎn)物電泳條帶清晰明亮，無拖尾現(xiàn)象，

11、可作為有效的樣本前處理方法。檢測的200例臨床樣本中，其中195例傳感器檢測結(jié)果，與臨床檢測結(jié)果相符合，靈敏度為97.3％，特異度為98％，可靠性為90％。
　　 結(jié)論：
　　 1.我們所構(gòu)建的新型SPR 生物傳感器微陣列，降低了溫度和電磁效應(yīng)對檢測穩(wěn)定性的影響，極大的減少了各檢測通道之間的信號干擾，從而達到了傳感器陣列化的要求，為DNA 檢測提供了背景噪音低、性能穩(wěn)定的微陣列檢測平臺。
　　 2.自行設(shè)計的16

12、S rDNA通用引物可以一次性對所有靶細菌16S rDNA 序列的順利擴增；設(shè)計的寡核苷酸探針特異性好，具有相同的雜交條件，較大的增加了傳感器微陣列的檢測通量，簡化了操作步驟。
　　 3.構(gòu)建的SPR 生物傳感器檢測系統(tǒng)，可以在4小時內(nèi)同時檢測四種臨床感染常見病原菌，檢測方法具有較高的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性，技術(shù)穩(wěn)定簡單易于掌握，成本低廉。為臨床病原菌的快速檢測乃至其他基因檢測提供一種新思路，有望克服臨床常規(guī)檢測方法存在的問題，