促紅細胞生成素對心肌細胞肥大影響的實驗研究.pdf

1、促紅細胞生成素(Erythropoietin,Epo)是一種低氧誘導(dǎo)的譜系特異性的內(nèi)分泌激素,可調(diào)節(jié)紅細胞的形成,臨床上廣泛應(yīng)用于各種原因引起的貧血,如終末期腎病、獲得性免疫缺陷綜合征以及需要化療的非造血系統(tǒng)惡性腫瘤。后來研究發(fā)現(xiàn)Epo受體在心血管系統(tǒng)有著廣泛的分布,基礎(chǔ)研究揭示Epo可保護缺血再灌注心肌和限制心肌梗死的范圍。有關(guān)Epo對心肌細胞肥大影響的報導(dǎo)在國內(nèi)外非常有限。本研究以Epo作為干預(yù)因素,離體培養(yǎng)新生大鼠心肌細胞作為研究

2、對象,以明確Epo對心肌肥大的影響并初步探討其肥厚相關(guān)的信號通路。
　　 第一部分新生大鼠心肌離體培養(yǎng)和Epo刺激后形態(tài)學(xué)觀察
　　 目的:1)取得穩(wěn)定的新生大鼠心肌細胞離體培養(yǎng)模型,cTnI免疫組化染色觀察Epo刺激不同時間對于心肌細胞大小的影響;2)觀察Epo刺激引起的細胞超微結(jié)構(gòu)改變。
　　 方法:取新生大鼠原代心肌細胞經(jīng)10％FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24h,更換為2％FBS低血清培液同步化24h。實驗分

3、為:空白對照組、AngⅡ組和Epo組。AngⅡ終濃度為1×10-6:Epo終濃度為10U/ml。于24h、48h和72h固定各組細胞,cTnI免疫組化染色,光鏡下測量心肌細胞面積。電鏡觀察心肌細胞超微結(jié)構(gòu)所用的低血清培養(yǎng)液含0.1％FBS,實驗分組同前。于24h、48h和72h固定各組細胞,電鏡下觀察各組心肌細胞超微結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果:1)干預(yù)24h,對照組心肌細胞面積2135.6±524.8μm2,AngⅡ干預(yù)組3202.3±

4、661.2μm2,Epo組2586.2±165.3μm2,AngⅡ組相比對照組和Epo組,心肌細胞明顯增大,P＜0.05。干預(yù)48h,對照組心肌細胞面積1844.5±323.3μm2,AngⅡ干預(yù)組3321.0±428.8μm2,Epo組3318.9±321.3μm2,AngⅡ組和Epo組相比對照組,心肌細胞明顯增大,P＜0.05;AngⅡ組與Epo組相比,差別無統(tǒng)計學(xué)意義。干預(yù)72h,對照組心肌細胞面積2213.90±149.51μm

5、2,AngⅡ干預(yù)組3222.20±225.3μm2,Epo組3317.20±196.1μm2,AngⅡ組和Epo組相比對照組,心肌細胞明顯增大,P＜0.05;AngⅡ組與Epo組相比,差別無統(tǒng)計學(xué)意義。Epo干預(yù)48h和干預(yù)72h相比24h組,細胞面積明顯增大,P＜0.05。2)電鏡觀察,培養(yǎng)72h,對照組心肌細胞肌絲溶解,細胞器大多破壞;AngⅡ組和Epo組細胞核不規(guī)則,核膜凹陷,核仁較清晰,染色質(zhì)淺;線粒體數(shù)量增多,腫脹;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及

6、高爾基器等與合成分泌有關(guān)的細胞器發(fā)達,72小時觀察到細胞內(nèi)出現(xiàn)亞細胞結(jié)構(gòu)的空泡化改變。
　　 結(jié)論:Epo刺激可使心肌細胞增大,使心肌細胞出現(xiàn)肥厚的亞細胞結(jié)構(gòu)改變。
　　 第二部分Epo對心肌細胞蛋白激酶活性及肥大相關(guān)基因的影響
　　 目的:考察Epo刺激后細胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK的激活和心肌細胞肥大相關(guān)基因ANP、BNP、c-fosmRNA的表達量的變化。
　　 方法:取新生大鼠原代心肌細胞經(jīng)10％FB

7、S的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24h,更換為0.1％FBS低血清培液同步化24h,加入Epo干預(yù)。1)Epo終濃度為10U/ml,分別在0min(對照組)、10min、15min、30min、60min和120min終止干預(yù),提取心肌細胞總蛋白,Westernblot檢測心肌細胞磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)含量;2)Epo終濃度為0U/ml(對照組)、5U/ml、10U/ml、100U/ml,干預(yù)30min,提取心肌細胞總蛋白,Wes

8、tern blot檢測心肌細胞p-ERK1/2含量:3)實驗分兩組,對照組和Epo組,Epo10U/ml干預(yù)30min,提取心肌細胞總RNA,RT-PCR法測定兩組c-fosmRNA表達量;同樣Epo和對照組分組干預(yù)2h,RT-PCR法測定ANPmRNA和BNPmRNA表達量。
　　 結(jié)果:1)Epo10U/ml干預(yù)心肌細胞后p-ERK2表達隨時間出現(xiàn)先升高后下降的變化,30min時達到高峰,與干預(yù)前和干預(yù)后120min相比,P

9、＜0.05;p-ERK1在Epo干預(yù)后也觀察到先升高后降低的趨勢。2)Epo不同濃度干預(yù)心肌細胞,隨Epo干預(yù)濃度增大,p-ERK2水平升高,10U/ml及100U/ml濃度干預(yù)組與對照組相比,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。P-ERK1在Epo處理后也觀察到隨濃度升高而升高的趨勢。3)Epo10U/ml干預(yù)心肌細胞,RT-PCR結(jié)果顯示,30minc-fosmRNA表達量與對照組相比差異不明顯,2hANP mRNA和BNP mRNA

10、表達量和對照組相比,明顯升高,P＜0.05。
　　 結(jié)論:1)Epo刺激使心肌細胞p-ERK1/2呈時間相關(guān)性和濃度依賴性升高;2)要觀察p-ERK1/2變化,可取Epo10U/ml刺激30min做為最佳觀察條件;2)Epo刺激促進了心肌肥大相關(guān)基因表達。
　　 第三部分Epo引起心肌細胞肥大反應(yīng)信號通路初探
　　 目的:1)觀察Epo刺激對心肌AGT mRNA表達量的影響;2)初步探討心肌中Epo-ERK信號通

11、路和RAS系統(tǒng)之間是否存在相互關(guān)系。
　　 方法:取新生大鼠原代心肌細胞經(jīng)10％FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24h,更換為0.1％FBS低血清培養(yǎng)液同步化24h,開始分組干預(yù)。
　　 1)Epo10U/ml干預(yù)細胞,分別在oh(對照組)、1h、2h、6h、12h、24h提取心肌細胞總RNA,RT-PCR法測定并比較干預(yù)不同時間后AGTmRNA表達量。
　　 2)實驗分為6組:a)空白對照組;b)AngⅡ組:AngⅡ

12、1×10-6M8min;c)ARB+AngⅡ組:替米沙坦1×10-6M阻斷30min后加入AngⅡ1×10-6M8min;d)Epo組:Epo10U/ml30min;e)ACEI+Epo組:依那普利1×10-6M阻斷2h后加入Epo10U/ml30min;f)ARB+Epo組:替米沙坦1×10-6M阻斷30min后加入Epo10U/ml30min。干預(yù)結(jié)束提取心肌細胞總蛋白,Western blot測定各組心肌細胞p-ERK1/2含量。

13、
　　 3)實驗分3組:a)空白對照組;b)Epo組:Epo10U/ml6h:c)PD98059+Epo組:PD98059濃度50×10-6M阻斷30min后加入Epo10U/ml6h。終止干預(yù),提取心肌細胞總RNA,比較三組的AGT mRNA表達量。
　　 結(jié)果:1)Epo10U/ml干預(yù)心肌細胞24h,使AGT mRNA表達量自2h起升高(P＜0.05),隨干預(yù)時間延長表現(xiàn)為先上升后下降趨勢,6h時AGTmRNA表達