綠膿桿菌RNA降解蛋白質PNPase和腸沙門氏菌鞭毛蛋白質fliD的初步晶體學研究.pdf

1、背景： RNA降解復合體是RNA在生物體內(nèi)更新的主要工具。PNPase通過的3’到5’核酸外切酶降解RNA。RraA是RNA降解復合體降解RNA過程中的重要抑制因子。鞭毛是細菌的重要成分也是致病因子之一,鞭毛的組裝是一個多蛋白質參與的復雜的過程。前期研究中成功解析了鞭毛FlgD蛋白質結構和純化了Rnase E抑制因子。通過對PNPase和RraA結構研究更能揭示RNA降解及其調節(jié)過程,通過對FliD結構研究進一步了解鞭毛的組裝機制。

2、r>　　 目的：本研究將對蛋白質PNPase、RraA和FliD純化,得到這三個蛋白質的蛋白質晶體,收集X-光衍射數(shù)據(jù)并解析他們的三維結構。
　　 方法：運用相關數(shù)據(jù)庫對目的蛋白質進行生物信息學的分析,通過分子克隆技術,克隆、表達、純化大量的純度大于95％的綠膿桿菌RNA降解酶PNPase蛋白質、綠膿桿菌Rnase E抑制因子RraA蛋白質和FliD蛋白質。用凝膠層析法檢測目的蛋白質在溶液中的聚集狀態(tài)。用晶體篩選試劑盒對目的蛋

3、白質篩選蛋白質晶體,并對初步得到的晶體進行優(yōu)化,以獲得高質量的晶體。用X衍射儀收集到得到蛋白質晶體的衍射數(shù)據(jù)。通過Pull-down方法驗證了PNPase和Rnase E的相互作用,并純化出該復合物用于晶體篩選。
　　 結果：通過分子克隆的技術,成功克隆、表達、純化了綠膿桿菌PNPase、Rnase E和RraA蛋白質,和腸沙門氏菌鞭毛帽FliD蛋白質。PNPase、RraA和FliD過分子篩Superdex200中顯示在溶液中