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文檔簡介
1、第一部分人類胚胎形態(tài)學分型與線粒體拷貝數(shù)、胚胎直徑、膜電位及分布關系的研究
目的:線粒體作為胚胎發(fā)育所需能量的供應源,所提供的能量直接影響著胚胎發(fā)育的潛能及胚胎的質量。本研究主要探討人類不同時期及相同時期不同形態(tài)學分型的胚胎與自身線粒體拷貝數(shù)、胚胎直徑、膜電位及分布的關系及對胚胎發(fā)育的影響。
方法:選擇行IVF-ET不孕患者新鮮周期卵母細胞正常受精后發(fā)育較差不適合移植的胚胎152枚,和助孕成功妊娠后自愿丟棄的冷凍胚胎
2、305枚。對于冷凍的胚胎要進行解凍復蘇,培養(yǎng)2h后放置倒置顯微鏡下觀察、拍照并進行胚胎形態(tài)學的分期、分級評分,把相同時期評分相同的胚胎分成一組。根據(jù)胚胎發(fā)育時期不同,將所有冷凍胚胎分成D3冷凍胚胎組(卵裂期胚胎n=144)及D5冷凍胚胎組(囊胚n=161)。根據(jù)同濟生殖中心胚胎培養(yǎng)室的胚胎評分標準,將卵裂期胚胎分為優(yōu)質胚胎組(n=89)、非優(yōu)質胚胎組(n=55)和新鮮胚胎組(不能移植的胚胎n=152),將冷凍囊胚分為優(yōu)質囊胚組(n=10
3、1)和非優(yōu)質囊胚組(n=60)。采用Real-time PCR檢測單個胚胎mtDNA拷貝數(shù)、熒光探針JC-10檢測胚胎線粒體△Ψm,熒光探針Mito Tracker Green對胚胎進行染色觀察線粒體的分布。比較不同階段胚胎和相同階段不同質量的胚胎與mtDNA拷貝數(shù)、胚胎直徑、△Ψm及線粒體分布的差異。
結果:
1、D3冷凍胚胎組mtDNA拷貝數(shù)明顯低于D5冷凍胚胎組(P<0.05);新鮮胚胎組mtDNA拷貝數(shù)明顯低
4、于D3冷凍優(yōu)質胚胎組和D3冷凍非優(yōu)質胚胎組(P<0.05),而D3冷凍優(yōu)質胚胎組mtDNA拷貝數(shù)與非優(yōu)質胚胎組差異無統(tǒng)計學差異;D5冷凍優(yōu)質囊胚組mtDNA拷貝數(shù)明顯高于非優(yōu)質囊胚組(P<0.05)。
2、D3冷凍胚胎組直徑明顯低于D5冷凍胚胎組(P<0.01),D3冷凍優(yōu)質胚胎組直徑與非優(yōu)質胚胎組差異無統(tǒng)計學意義,D5冷凍優(yōu)質囊胚組直徑明顯高于非優(yōu)質囊胚組(P<0.05)。
3、D3冷凍胚胎組線粒體△Ψm明顯低于D
5、5冷凍胚胎組(P<0.05),新鮮胚胎組線粒體△Ψm明顯低于D3冷凍優(yōu)質胚胎組和D3冷凍非優(yōu)質胚胎組(P<0.01,P<0.05),D3冷凍優(yōu)質胚胎組線粒體△Ψm高于非優(yōu)質胚胎組(P<0.05),D5冷凍優(yōu)質囊胚組線粒體△Ψm明顯高于非優(yōu)質囊胚組(P<0.01)。
4、D3冷凍優(yōu)質胚胎組的線粒體均勻分布于每個卵裂球內,且染色均勻;而D3冷凍非優(yōu)質胚胎組線粒體不均勻的分布在卵裂球內,且卵裂球染色不均勻;新鮮胚胎組的線粒體彌散在胞
6、質內,且呈不均勻分布;D5冷凍優(yōu)質囊胚組線粒體主要密集在內細胞團核周圍較寬的區(qū)域,染色較深且均勻,而D5冷凍非優(yōu)質囊胚組線粒體主要彌散在內細胞團核周圍,染色較淺且不均勻。
結論:
1、隨著胚胎的不斷發(fā)育mtDNA拷貝數(shù)是逐漸增高,質量越好胚胎mtDNA拷貝數(shù)越高。
2、D5冷凍胚胎組胚胎形態(tài)學分型越好的胚胎直徑越大,mtDNA拷貝數(shù)與胚胎直徑呈正相關。
3、隨著胚胎的不斷發(fā)育mt△Ψm是逐漸增高,
7、質量越好的胚胎△Ψm越高。
4、線粒體均勻的分布在卵裂球和內細胞團核周圍較寬的區(qū)域,胚胎有較好的發(fā)育潛能。
第二部分人類胚胎形態(tài)學分型與胚胎內ATP、ROS及Ca2+水平關系的研究
目的:ATP是卵母細胞成熟、受精及胚胎發(fā)育的能量保證,ROS是胚胎內重要的氧化還原信號分子,Ca2+是胚胎代謝活動中重要的第二信使,三者均是線粒體的產物并存在密切的相互作用,并通過作用于線粒體而參與胚胎內細胞的增殖、分化和凋亡過
8、程。本研究主要探討人類不同時期及相同時期不同形態(tài)學分型的胚胎與胚胎內ATP、ROS和Ca2+水平的關系及對胚胎發(fā)育的影響。
方法:選擇行IVF-ET不孕患者新鮮周期卵母細胞正常受精后發(fā)育較差不適合移植的胚胎152枚,和助孕成功妊娠后自愿丟棄的冷凍胚胎305枚。對于冷凍的胚胎要進行解凍復蘇,培養(yǎng)2h后放置倒置顯微鏡下觀察、拍照并進行胚胎形態(tài)學的分期、分級評分,把相同時期評分相同的胚胎分成一組。根據(jù)胚胎發(fā)育時期不同,將所有冷凍胚胎
9、分成D3冷凍胚胎組(卵裂期胚胎n=144)及D5冷凍胚胎組(囊胚 n=161)。根據(jù)同濟生殖中心胚胎培養(yǎng)室的胚胎評分標準,將卵裂期胚胎分為優(yōu)質胚胎組(n=89)、非優(yōu)質胚胎組(n=55)和新鮮胚胎組(不能移植的胚胎 n=152),將冷凍囊胚分為優(yōu)質囊胚組(n=101)和非優(yōu)質囊胚組(n=60)。采用熒光素酶法檢測單個胚胎ATP水平,活性氧檢測試劑盒檢測胚胎內ROS的水平,鈣離子熒光探針檢測胚胎內Ca2+水平,比較不同階段胚胎和相同階段不
10、同質量的胚胎與胚胎內ATP、ROS及Ca2+水平的差異。
結果:
1、D3冷凍胚胎組線粒體ATP明顯低于D5冷凍胚胎組(P<0.05),新鮮胚胎組線粒體ATP低于D3冷凍優(yōu)質胚胎組和D3冷凍非優(yōu)質胚胎組(P<0.05),D3冷凍優(yōu)質胚胎組線粒體ATP高于非優(yōu)質胚胎組(P<0.05),D5冷凍優(yōu)質囊胚組線粒體ATP明顯高于非優(yōu)質囊胚組(P<0.05)。
2、D3冷凍胚胎組線粒體ROS明顯低于D5冷凍胚胎組(P
11、<0.05),新鮮胚胎組線粒體ROS高于D3冷凍優(yōu)質胚胎組和D3冷凍非優(yōu)質胚胎組(P<0.01,P<0.05),D3凍胚優(yōu)質胚胎組線粒體ROS低于非優(yōu)質胚胎組(P<0.05),D5凍胚優(yōu)質囊胚組線粒體ROS低于非優(yōu)質囊胚組(P<0.05)。
3、D3冷凍胚胎組線粒體Ca2+明顯低于D5冷凍胚胎組(P<0.05),新鮮胚胎組線粒體Ca2+高于D3冷凍優(yōu)質胚胎組和D3冷凍非優(yōu)質胚胎組(P<0.01,P<0.05),D3凍胚優(yōu)質胚胎
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