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文檔簡介
1、 本研究前期工作首次發(fā)現(xiàn)表達于細胞表面含有點突變的αⅡbβ3-Cys5Ala、αⅡbβ3-Cys435Ala、αⅡbβ3-Cys560Arg及αⅡbβ3-Cys583Ala不需配體誘導而呈持續(xù)的激活狀態(tài),它們介導細胞內信號傳導、配體結合的能力均高于正常。上述發(fā)現(xiàn)提供了分子內Cys5-Cys435、Cys560-Cys583二硫鍵存在的功能性證據(jù),并闡明二硫鍵參與αⅡbβ3的構象調節(jié)和激活過程的分子機理。 在前期工作基礎上通過流式
2、細胞術對本實驗室已構建的整合素αVβ3-WT、αVβ3-Cys5Ala、αVβ3-Cys435Ala、αVβ3-Cys560Arg及αVβ3-Cys583Ala進行表達量及激活狀態(tài)分析,發(fā)現(xiàn)整合素αVβ3-Cys5Ala、αVβ3-Cys435Ala、αVβ3-Cys560Arg及αVβ3-Cys583Ala不需配體誘導而呈持續(xù)的激活狀態(tài),且CHO-αVβ3-WT和CHO-αVβ3-Cys560Arg表達量相近。通過SCID小鼠腫瘤遷移
3、動物模型的初步探索發(fā)現(xiàn),與對照組相比,10天后,尾靜脈注射CHO細胞的SCID小鼠肺部表面出現(xiàn)瘤結,后經(jīng)組織形態(tài)學分析,肺部內部出現(xiàn)典型的腫瘤病灶。但此模型的各項條件有待進一步優(yōu)化。 為了觀察在整合素其它β亞基中產(chǎn)生相應的突變是否也會出現(xiàn)類似的結果,通過對β3、β1和β5同源性分析,采用PCR方法擴增了對應于β3的第5與435位Cys的β1-Cys7Ala、β1-Cys442Ala、β5-Cys5Ala及β5-Cys440Ala突
4、變體片段及β1、β5野生型片段,并構建了相應的pCDNA3.1C表達載體。經(jīng)WesternBlot檢測,成功實現(xiàn)了β1-WT、β1-Cys7Ala及β1-Cys442Ala在COS7細胞中的瞬時表達。同時將αV分別與β5野生型及突變體共轉染,經(jīng)篩選后,獲得了一批整合素αVβ5野生型及其突變體的穩(wěn)定細胞株,有待進一步流式細胞術及WesternBlot分析。 本研究為深入研究整合素激活狀態(tài)在腫瘤轉移過程中的作用進而研制具有抑制活性
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