低氧調控糖皮質激素受體α表達及其核轉位的分子機制研究.pdf

1、研究背景：
　　糖皮質激素（glucocorticoids，GC）因其抗炎、抑制免疫、抗休克和抗毒等藥理作用，廣泛應用于治療各種免疫炎癥性疾病，包括哮喘、慢性阻塞性肺病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）、肺間質纖維化等呼吸系統(tǒng)疾病。當GC與糖皮質激素受體（glucocorticoids receptor，GR）結合后,其伴侶蛋白熱休克蛋白90（hot shock protein

2、90，HSP90）構象發(fā)生改變, GRα-GC復合物與HSP90等配體成分分離，HSP90脫落，形成激素-受體復合物，GRα核易位進入細胞核,在胞核內與激素應答基因啟動區(qū)的激素反應元件(glucocorticoid response elements， GRES)結合,從而導致相應基因的轉錄活性增強并調控激素相關基因表達，產生生理及藥理作用。
　　糖皮質激素的作用包括與受體結合及GC與GR結合之后引起的核轉位過程是極其復雜的，機體

3、的功能狀態(tài)及細胞所處的微環(huán)境均可影響其作用發(fā)揮。哮喘及慢性阻塞性肺病急性發(fā)作均存在不同程度的低氧血癥，前期研究顯示低氧時間依賴性抑制肺泡上皮A549細胞GRα的表達，但其信號通路及機制不明，且低氧是否會影響GRα核轉位尚不清楚。
　　研究目的：
　　本研究建立哮喘小鼠動物模型，明確哮喘急性發(fā)作是否存在GRα的表達改變及低氧血癥。體外實驗以人肺泡上皮A549細胞為模型，觀察低氧對GRα表達及MAPK信號通路的影響，靶向干預MA

4、PK信號通路，觀察GRα表達的變化，揭示低氧抑制GR表達的可能通路。觀察低氧對TLR2信號通路及Hif-1的影響，分別靶向干預TLR2信號通路及Hif-1，檢測TLR2信號蛋白、Hif-1及GR表達的變化，揭示低氧抑制GR表達的可能通路及TLR2與Hif的內在關系。轉染GFP標記的GRα質粒入A549細胞，觀察低氧對GRα核轉位的影響。本研究旨在揭示低氧抑制GRα表達及核轉位的分子機制，為激素抵抗型哮喘的靶向干預提供理論依據和治療方向。

5、
　　研究方法：
　　1.建立OVA哮喘小鼠模型，實驗分組包括正常對照組，哮喘組，TLR2-/-哮喘組，免疫組化方法及Western Blot檢測GRα及Hif-1蛋白表達的變化。
　　2.低氧培養(yǎng)A549細胞人肺泡上皮A549細胞放入普通培養(yǎng)箱（37℃，95％空氣，5%CO2），給予化學性低氧條件（COCL2，1200umol/L）培養(yǎng)0h，2h，4h，6h，8h，12h，24h。
　　3.Western Bl

6、ot法檢測低氧對各組細胞GRα、Hif-1、TLR2及MAPK信號家族包括磷酸化cJNK、ERK，p38表達的影響；靶向干預MAPK信號通路蛋白，觀察GRα表達的變化；轉染Hif-1及TLR2siRNA質粒對之進行特異性干擾，檢測MAPK信號通路蛋白及GRα的改變。
　　5.以脂磷壁酸激活TLR2通路蛋白，觀察TLR2信號通路激活狀態(tài)下GRα、Hif-1及TLR2表達的變化；
　　6.將A549細胞轉染帶綠色熒光標記的GFP

7、-GRα質粒，運用活細胞動態(tài)工作站動態(tài)觀察常氧及化學性低氧狀態(tài)下糖皮質激素誘發(fā)GRα入核的時間及程度的變化。7.免疫共沉淀法檢測低氧對GR-HSP90二聚體解離的影響。
　　8.統(tǒng)計方法實驗數(shù)據均采用均數(shù)±標準誤表示，每部分實驗均獨立進行3次完成。多組間差異采用one-way ANOVA方法分析，兩組之間差異采用獨立樣本t檢驗，采用SPSS19.0軟件包進行數(shù)據分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　研究結果：

8、　　1.野生型哮喘小鼠肺組織中Hif-1表達顯著增強，GRα的表達下降，
　　免疫組化的結果顯示哮喘小鼠模型肺組織Hif-1陽性表達的細胞比率顯著高于正常組小鼠肺組織細胞，IOD值高于正常對照組；GRα陽性表達細胞比率顯著低于正常組小鼠，IOD值低于正常對照組，上述結果提示哮喘小鼠肺組織較之正常小鼠肺組織存在低氧狀態(tài)，并且GRα表達顯著下降。TLR2-/-哮喘小鼠肺組織Hif-1陽性表達的細胞比率顯著高于正常組小鼠肺組織；GRα陽

9、性表達細胞比率顯著低于正常組小鼠。
　　2.低氧時間依賴性下調GRα表達、激活MAPK信號通路，伴隨著Hif-1及TLR2表達上調。
　　低氧培養(yǎng)（氯化鈷1200umol/L）肺泡上皮A549細胞，培養(yǎng)不同時間，WesternBlot觀察不同時間點GRα和Hif-1蛋白表達的變化，發(fā)現(xiàn)隨低氧作用時間延長， GRα表達逐漸下降，而Hif-1及TLR2表達顯著上升。低氧呈時間依賴性激活p38，JNK及ERK通路。
　　3.

10、靶向抑制p38信號通路可抵抗低氧導致的GRα下調。靶向干擾Hif-1可以抑制pJNK、pp38及TLR2活化，并且上調GRα表達。
　　分別預先加入SP600125，SB203580，U0126靶向抑制JNK，p38，ERK1/2信號蛋白，作用兩小時后更換培養(yǎng)基，加入 COCL2，作用12h，通過對蛋白的半定量分析，結果顯示抑制p38信號通路后，低氧所導致的GRα下調可以得到一定程度的修復。靶向干擾低氧環(huán)境下激活的Hif-1及TL

11、R2信號，Hif-1靶向干擾后， pERK活化未受到抑制，而活化的pp38及pJNK受到顯著抑制，且TLR2信號受到抑制。靶向干擾Hif-1可以上調低氧環(huán)境下受到抑制的GRα表達。TLR2靶向干擾后對GRα表達，Hif-1及MAPK信號家族的激活未有明顯影響。
　　4.低氧顯著抑制GRα核轉位。
　　常氧狀態(tài)下，細胞培養(yǎng)基中加入10-5DXM后，活細胞動態(tài)顯示GRα迅速在10min內全部轉移進入細胞核內，低氧培養(yǎng) A549細

12、胞，同樣加入10-5DXM入細胞培養(yǎng)基，顯示GRα入核的速度明顯減慢，并有一定比例的GRα不轉移入細胞核。
　　5.低氧抑制GRα與HSP的解離。
　　我們利用HSP和GRα可以相互結合的原理，用HSP90特異性吸附GRα，然后用Westernblot方法檢測GRα的表達量，實驗分為低氧和常氧組，低氧狀態(tài)下被HSP90吸附可以檢測的GRα量顯著高于常氧狀態(tài)下的GRα表達量。說明在低氧狀態(tài)下與HSP90結合的GRα多于低氧狀態(tài)

13、與HSP90的結合。
　　7. LTA刺激可以引起TLR2表達上升，GRα表達降低，Hif-1信號表達未見明顯變化。
　　將A549細胞給予LTA處理，WesternBlot檢測發(fā)現(xiàn)TLR2信號激活，但對Hif-1蛋白無明顯影響，GRα表達有一過性下降。
　　研究結論：
　　1.哮喘小鼠肺組織里的GRα表達顯著低于正常的小鼠肺組織；相反Hif-1表達在小鼠肺組織中明顯增高。
　　2．低氧通過激活MAPK信號