雄激素對小鼠海馬突觸蛋白表達的調節(jié)及其機制的初步研究.pdf

1、阿爾茲海默病(Alzheimer's disease，AD)，又被稱做老年癡呆，是一種中樞神經系統(tǒng)變性病，起病隱匿，病程呈慢性進行性。目前，全球AD患者人數已近2000萬，且患病人數仍然在增加。我國65歲以上老人發(fā)病率為5％，75歲以上老人發(fā)病率為10％，85歲以上發(fā)病率達到20％。主要表現為一系列的神經精神癥狀如漸進性認知功能和記憶障礙、人格和行為改變以及語言障礙等，是當今老齡化社會極難解決的醫(yī)學難題之一。雖然近年在其治療方面有一定的

2、突破，但對正在飽受煎熬的老年癡呆癥患者來說，宛如杯水車薪，并沒有實際上的改變。這不僅給家庭和社會帶來沉重的經濟和精神負擔，對家庭護理和臨床護理工作也帶來嚴峻的挑戰(zhàn)。
　　已有研究證明認知功能的下降與雄激素水平降低有關，其調節(jié)腦結構與功能有兩種方式，一種是通過雄激素受體的直接作用方式，二是在芳香化酶催化下轉化為雌激素（內源性雌激素）進而通過雌激素受體（核受體ERα，ERβ和膜性受體GPR30）的間接方式。我們前期的研究發(fā)現向雄性小鼠

3、腹腔注射芳香化酶抑制劑LET抑制芳香化酶的活性可誘導突觸蛋白的表達下降與學習記憶行為的顯著改變，而卵巢切除僅可導致突觸蛋白的輕微下調但是并無學習記憶行為的顯著改變，提示雄激素的內源性雌激素作用途徑可能在調節(jié)突觸可塑性尤其是影響學習記憶方面發(fā)揮了主要作用，但是其具體的調節(jié)途徑猶未可知，雄激素對海馬突觸可塑性的調節(jié)究竟涉及到哪一種或哪幾種受體尚不清楚。
　　已有研究表明雄激素等神經類固醇激素可通過其核受體影響神經系統(tǒng)的結構和功能。核受

4、體調節(jié)靶基因轉錄則需類固醇受體輔助活化因子-1(steroid receptor coactivator-1，SRC-1)等輔助活化因子的參與。SRC-1能以配體依賴方式顯著增強多種核受體的轉錄活性，抑制腦內SRC-1的表達則可導致腦發(fā)育、行為和生理性改變等。在中樞神經系統(tǒng)中類固醇激素作用的重要功能區(qū)域是海馬，SRC-1在小鼠海馬細胞核內也有高表達，其被證實在大腦突觸可塑性、學習記憶等高級認知活動中發(fā)揮著重要作用。然而在海馬，SRC-1

5、是否介導了雄激素對海馬突觸蛋白表達的調節(jié)尚未見文獻報道。
　　基于以上問題，我們通過在體經典的睪丸切除模型模擬老化后雄激素水平降低，采用免疫組化和Westen Blot技術檢測了在睪丸切除后給予0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg的丙酸睪酮(Testosterone，T)分別處理2周、4周后海馬AMPA受體亞型谷氨酸受體-1(GluR1)、突觸后致密物蛋白-95(Postsynaptic density prote

6、in-95，PSD-95)、雄激素受體(Androgen Receptor，AR)、雌激素核受體(Estrogen Receptor，ERα、Estrogen Receptor，ERβ)、雌激素膜受體(G Protein-coupled Receptor30，GPR30)、SRC-1的表達變化以明確雄激素水平下降與學習記憶認知的關系。之后我們采用離體實驗，加入各受體及SRC-1抑制劑檢測以上相關突觸蛋白及受體表達的變化，并采用統(tǒng)計學方法

7、進行了相關性分析，以初步探討雄激素調節(jié)海馬突觸蛋白表達的機制，以期為深入闡明老年癡呆的發(fā)病機制以及開發(fā)更有效的預防或治療老年癡呆的藥物提供新的基礎資料，為護理同仁大大減輕工作負擔。
　　主要結果:
　　1、GluR1、PSD-95、AR、ERα、ERβ、SRC-1在成年雄性小鼠海馬區(qū)均有廣泛表達，在去勢后其表達均有顯著降低，給予不同時間不同劑量雄激素替代后各分子有著不同的變化。GPR30和樹突棘素Spinophilin(Sp

8、ino)在去勢后表達未有統(tǒng)計學差異。
　　2、去勢給予短時雄激素替代后（劑量0.5mg/kg,1.0mg/kg，2.0mg/kg），海馬區(qū)突觸蛋白GluR1在0.5mg/kg的劑量下表達較去勢組略有上升，在1.0mg/kg的劑量下表達則顯著上升，而在2.0mg/kg的劑量下表達則又降低。突觸蛋白PSD-95在0.5mg/kg的劑量下表達較去勢組有上升，在1.0mg/kg的劑量下表達則顯著上升，而在2.0mg/kg的劑量下仍在較高水

9、平。核受體AR、ERα、ERβ在0.5mg/kg的劑量下表達較去勢組略有上升，在1.0mg/kg的劑量下表達則顯著上升，而在2.0mg/kg的劑量下表達則又降低。SRC-1在0.5mg/kg的劑量下SRC-1表達較去勢組略有上升，在1.0mg/kg的劑量下表達則顯著上升，而在2.0mg/kg的劑量下則表達有所降低。而GPR30和Spino的變化則無統(tǒng)計學差異。
　　3、去勢給予長時雄激素替代后(劑量0.5mg/kg，1.0mg/k

10、g，2.0mg/kg)，海馬區(qū)突觸蛋白GluR1、PSD-95在0.5mg/kg的劑量下表達較去勢組略有上升，在1.0mg/kg的劑量下表達則顯著上升，而在2.0mg/kg的劑量下表達則又降低。核受體AR在0.5mg/kg的劑量下表達較去勢組略有上升，在1.0mg/kg的劑量下表達則顯著上升，而在2.0mg/kg的劑量下表達則又降低。核受體ERβ在0.5mg/kg和1.0mg/kg的劑量下表達較去勢組略有上升，而在2.0mg/kg的劑量

11、下表達有顯著升高。GPR30在雄激素替代劑量為1.0mg/kg時其表達有顯著升高。SRC-1在0.5mg/kg的劑量下SRC-1表達較去勢組略有上升，在1.0mg/kg的劑量下表達則顯著上升，而在2.0mg/kg的劑量下則表達有所降低。而ERα和Spino的變化則無統(tǒng)計學差異。
　　4、去勢短時雄激素替代，雄性小鼠海馬內AR、ERα、ERβ表達的變化與GluR1和PSD-95存在高度一致的線性相關關系;AR、 ERα、ERβ表達的

12、變化與SRC-1存在高度一致的線性相關關系;SRC-1表達的變化與GluR1、PSD-95存在高度一致的線性相關關系。去勢長時雄激素替代，雄性小鼠海馬內AR表達的變化與ERβ、GluR1均存在高度一致的線性相關關系;SRC-1表達的變化與GluR1存在高度一致的線性相關關系。
　　5、離體實驗中，給予海馬神經元細胞株適量雄激素處理，突觸蛋白GluR1和PSD-95、SRC-1的表達均有所上升，而GluR1在加入AR拮抗劑Fluta

13、mide(Flu)、ERα拮抗劑MPP、ERβ拮抗劑PHTPP(PHT)后表達明顯下降，PSD-95在加入Flu、MPP、PHT、G15后均有表達下降，SRC-1在Flu、MPP、G15后均有表達下降，Spino則無明顯變化。在給予海馬神經元細胞株適量雄激素處理的基礎上給予SRC-1抑制劑bufalin(Bu)，GluR1、PSD-95 AR、ERβ在給予適量雄激素后較溶劑對照組明顯升高，在給予Bu后AR、ERα、ERβ、GPR30、G

14、luR1和PSD-95表達明顯下降。Spino表達略微下降，卻無統(tǒng)計學差異。
　　主要結論:
　　1、睪丸切除能降低成年雄性小鼠海馬突觸蛋白GluR1、PSD-95的表達，給予雄激素替代后則明顯上升，結合離體實驗中給予適量雄激素后海馬神經元GluR1、PSD-95表達升高，提示在一定時間和劑量下雄激素可正向調節(jié)海馬突觸蛋白的表達，進而影響其突觸可塑性。
　　2、睪丸切除能降低成年雄性小鼠海馬核受體AR、ERα、ERβ，

15、給予雄激素替代后則明顯上升，且AR、ERα、ERβ的變化趨勢與GluR1、PSD-95的變化趨勢高度相關，結合離體實驗中，給予Flu、MPP、PHT均可致GluR1、 PSD-95表達降低，提示雄激素可通過其直接受體途徑AR和間接受體途徑ERα、ERβ調節(jié)突觸蛋白的表達。
　　3、睪丸切除后能降低成年雄性小鼠海馬SRC-1的表達，給予雄激素替代后則明顯上升，且SRC-1的變化趨勢與核受體AR、ERα、ERβ及突觸蛋白GluR1、P

16、SD-95的變化趨勢呈高度相關。結合離體實驗中，給予Bu后AR、ERα、ERβ、GPR30及突觸蛋白GluR1、PSD-95均表達下降，提示SRC-1可能在雄激素通過其直接受體途徑AR和間接受體途徑ERα、ERβ和/或GPR30調節(jié)海馬突觸發(fā)生中具有重要介導作用。這種調節(jié)可能進一步導致海馬突觸可塑性的變化，進而導致老化中學習記憶功能的下降。
　　4、睪丸切除分別給予不同劑量的長時和短時雄激素替代后，GluR1、PSD-95均呈倒“

17、U”型表現，長時雄激素替代后ERα表達無明顯變化、GPR30表達上升顯著，結合離體實驗結果提示雄激素劑量過大或替代時間延長可能會有神經毒性作用，導致突觸蛋白表達的障礙且其作用途徑之間會發(fā)生改變。
　　綜上可知，本研究運用免疫組織化學技術(IHC)、Western blot等實驗技術，研究了睪丸切除后成年雄性小鼠腦內海馬區(qū)GluR1、PSD-95、AR、ERα、ERβ、GPR30、SRC-1的表達變化以及AR、ERα、ERβ和SRC