27nt miRNA對eNOS調節(jié)及HUVECs增殖相關因子AP-1作用機制研究.pdf

1、目的:
　　前期工作發(fā)現，內皮型一氧化氮合酶第4內含子的27堿基重復子產生相應27nt miRNA，并對eNOS的轉錄和表達有負反饋調節(jié)作用。進一步探討該內含子源性27nt miRNA對內皮型一氧化氮合酶基因調節(jié)的分子機制及臍靜脈內皮細胞增殖相關轉錄因子AP-1的作用機制。
　　1.明確27nt miRNA對內皮細胞表型的調控作用
　　2.闡明27nt miRNA抑制內皮細胞增殖和轉移的機制。
　　3.旨在從新的

2、角度闡明內皮細胞增殖、遷移和侵襲的分子機制，為尋找新的心血管疾病治療靶點提供理論依據。
　　方法:
　　1.體外觀察27nt miRNA對內皮細胞生物學性狀的影響:將人工合成的wt-27nt miRNA和mut-27nt miRNA mimics分別轉染內皮細胞，觀察內皮細胞的增殖（MTT法和細胞克隆法）、遷移（細胞劃痕實驗）、侵襲（Transwell實驗）等生物學行為的變化。
　　2.27nt miRNA下游靶基因的

3、預測、驗證和功能研究:我們使用TargetScan靶基因預測軟件并分析相關因素，篩選27nt miRNA可能的下游靶基因AP-1。然后。應用熒光素酶報告系統(tǒng)驗證27nt miRNA對AP-1的負性調控作用。進一步采用qRT-PCR、免疫組化和免疫印跡實驗(western blotting)檢測靶基因AP-1 mRNA和蛋白和eNOSmRNA和蛋白表達水平的改變。
　　3.在VEGF生長因子刺激下，進一步采用qRT-PCR和免疫印跡

4、實驗(western blotting)檢測共轉染27nt miRNA和AP-1后eNOS mRNA和蛋白表達水平的改變，最后應用MTT法觀察內皮細胞的增殖情況。
　　結果:
　　1.過表達27nt miRNA對內皮細胞的增殖和遷移以及侵襲具有顯著的抑制作用，
　　2.通過生物信息學的預測發(fā)現，AP-1可能是27nt miRNA的下游一個靶基因，熒光素酶報告表明，27nt miRNA對于它結合位點熒光報告基因活性具有顯

5、著抑制作用，但其對突變體和對照質粒的活性卻沒有顯著性的影響。前期工作發(fā)現，eNOS不是27nt miRNA的預測靶基因，過表達27nt miRNA對eNOS mRNA以及蛋白表達水平有明顯影響。以上研究證實27nt miRNA通過轉錄后水平負性調控AP-1參與內皮細胞的侵襲和轉移。
　　3.在VEGF的刺激下，共轉染27nt miRNA和AP-1對eNOS mRNA和蛋白水平影響更為顯著。
　　結論:
　　1.過表達2