老鷹茶總黃酮中主要黃酮苷類與其苷元的腸道轉運特性及抗人肝癌細胞耐藥的機制研究.pdf

1、老鷹茶，又名豹皮樟，俗稱“白茶”，是具有安徽地域特色的中藥資源，主要分布于安徽省皖南山區(qū)。民間飲用表明老鷹茶具有解毒消腫、明目益思、生津止渴、解表防暑等功效。前期的研究表明，老鷹茶總黃酮 TFLC為其活性部位，主要成分為槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷和山奈酚-3-O-β-L-鼠李糖苷這五種黃酮苷類，其在降血糖、抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等

2、方面均具有顯著預防和治療作用。黃酮苷元槲皮素和山奈酚藥理作用與老鷹茶總黃酮的藥理作用相似，也具有抗炎、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)等作用。雖然這些黃酮類化合物的很多藥理活性被研究報道，但是關于它們的吸收特點和機理尚不明確。
　　口服給藥是常用的給藥方式。腸道吸收作為口服藥物進入人體的第一步，決定了藥物的生物利用度和代謝動力學行為。構建一種細胞體外吸收模型來模擬人體小腸上皮的功能，對闡明藥物在腸道的吸收特性，明確影響藥物吸收和生物利用度的潛在因

3、素至關重要。
　　ABC（ATP-binding cassette，ATP結合盒）轉運蛋白是一類具有ATP結合區(qū)域單向底物外排泵，主要參與細胞內(nèi)藥物吸收轉運和外排等過程，以主動轉運方式完成多種分子的跨膜轉運。目前已有研究證實，ABC轉運蛋白家族中的P-糖蛋白（P-gp）、多藥耐藥相關蛋白2（MRP2）與腫瘤細胞化療中產(chǎn)生的多藥耐藥性（mulitidrug resistance，MDR）密切相關，但具體機制不詳。
　　因此本課

4、題以Caco-2、MDCK及人肝癌耐藥細胞株為研究對象，從以下三個方面開展實驗，研究老鷹茶總黃酮中主要黃酮苷類及其相對應的黃酮苷元的吸收轉運特性，同時探討這些成分與轉運蛋白之間的相互作用及機制。
　　一、老鷹茶總黃酮中主要黃酮苷類與其苷元在Caco-2/MDCK細胞上的吸收轉運
　　實驗利用Caco-2和MDCK兩種細胞模型模擬人體小腸上皮，在細胞水平上研究老鷹茶總黃酮中主要黃酮苷類及其苷元的吸收特性、轉運機理以及相互作用。

5、在實驗考察的轉運濃度范圍內(nèi)（40、80、160μM），山奈酚-3-O-β-L-鼠李糖苷的跨細胞轉運可能以被動擴散為主，而槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素和山奈酚在雙向轉運過程中都具有濃度依賴性、pH值依賴性和能量依賴性，提示它們的跨細胞轉運過程可能既有被動擴散，又有主動轉運。槲皮素和山奈酚具有明顯的外排現(xiàn)象，外排率ER遠遠大于2

6、。主動轉運蛋白（SGLT1）的抑制劑根皮苷對槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷和山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷的吸收有一定的促進作用，易化擴散蛋白（GLUT2）抑制劑根皮素對槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷和山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷的吸收均有一定的促進作用。P-糖蛋白（P-gp）抑制劑維拉帕米對于黃酮苷類的外排沒有明顯的作用，但是對其苷元槲皮素和山奈酚的外排有抑

7、制作用；而多藥耐藥相關蛋白2（MRP2）抑制劑MK571和丙磺舒對于黃酮苷類和苷元的外排均有不同程度的抑制。當這些成分兩兩相互作用后，苷元槲皮素和山奈酚可以促進部分黃酮苷類的吸收，苷元槲皮素和山奈酚之間可以相互促進，但是黃酮苷類之間卻沒有明顯的促進或抑制作用。
　　二、老鷹茶總黃酮中主要黃酮苷類與其苷元對Caco-2細胞和人肝癌耐藥BEL-7402/5-FU細胞中ABC轉運蛋白的調(diào)控作用
　　由于 ABC轉運蛋白在藥物吸收動

8、力學中發(fā)揮著很重要的作用，因此實驗考察了黃酮苷類及其苷元對 Caco-2細胞和人肝癌耐藥 BEL/5-FU細胞中ABC轉運蛋白（MDR1/P-gp、MRP2）表達和功能活性的影響。在Caco-2細胞單層中，黃酮苷元槲皮素（40、80、160μM）和山奈酚（80、160μM）可以明顯降低轉運蛋白底物的外排率，但是黃酮苷類對轉運蛋白的功能沒有明顯的作用。BEL/5-FU細胞經(jīng)過苷元槲皮素（40、80、160μM）預處理后，能夠明顯下調(diào)轉運蛋

9、白基因的表達，增強細胞內(nèi)轉運蛋白底物的熒光強度，作用類似于轉運蛋白的抑制劑。同時，BEL/5-FU細胞經(jīng)過槲皮素（40、80、160μM）預處理后，能夠明顯降低5-FU的IC50值，增加細胞敏感性，逆轉了細胞耐藥性。
　　三、黃酮苷元槲皮素通過抑制FZD7/β-catenin通路下調(diào)人肝癌耐藥細胞BEL-7402/5-FU中ABC轉運蛋白的表達逆轉多藥耐藥
　　近年來，ABC轉運蛋白介導的多藥耐藥在肝癌耐藥中占有很大的比例，

10、因此對ABC轉運蛋白進行干預成為逆轉肝癌化療耐藥的重要途徑。越來越多的研究表明Wnt/β-catenin信號通路與ABC轉運蛋白之間有密切的聯(lián)系。文獻報道Wnt蛋白的受體Frizzled(FZD)7在肝癌耐藥細胞株中過表達，作為Wnt/β-catenin通路必不可少的組成元件，F(xiàn)ZD7表達的改變可影響信號通路的調(diào)控進而逆轉腫瘤耐藥。前期研究發(fā)現(xiàn)黃酮苷元槲皮素可以濃度依賴性地抑制 ABC轉運蛋白的表達和功能。為了考察黃酮苷元槲皮素對 AB

11、C轉運蛋白的調(diào)控機制，進行了相關實驗研究。結果發(fā)現(xiàn) BEL-7402和BEL/5-FU細胞中FZD7、MDR1/P-gp和MRP2均異常表達，而在BEL/5-FU耐藥細胞株中的表達均明顯高于其親本細胞株BEL-7402。轉染FZD7 siRNA（siFZD7）有效沉默F(xiàn)ZD7后，細胞漿內(nèi)β-catenin、細胞核內(nèi)β-catenin、MDR1/P-gp、MRP2的mRNA和蛋白水平均明顯下降，5-FU、MMC和ADR的IC50值明顯下降

12、，BEL/5-FU細胞內(nèi)Rh123和ADR的蓄積量增加；轉染過表達質(zhì)粒GV144-FZD7后與siFZD7的結果相反。β-catenin的抑制劑iCRT-3也能明顯抑制下游MDR1/P-gp和MRP2的mRNA和蛋白表達水平。當用不同濃度的槲皮素（40、80、160μM）處理耐藥細胞后，發(fā)現(xiàn)其能夠明顯抑制FZD7、細胞漿內(nèi)β-catenin、細胞核內(nèi)β-catenin、MDR1/P-gp、MRP2的mRNA和蛋白表達，具有濃度依賴性。同

13、時，與槲皮素加siFZD7的陰性對照組 sncRNA（Q+sncRNA）相比，槲皮素加siFZD7共同處理組（Q+siFZD7）可使得FZD7、細胞漿內(nèi)β-catenin、細胞核內(nèi)β-catenin、MDR1/P-gp、MRP2 mRNA和蛋白表達水平明顯增加。提示槲皮素調(diào)控ABC轉運蛋白（MDR1/P-gp、MRP2）的表達可能與抑制FZD7/β-catenin信號通路有關。
　　綜上可知，老鷹茶總黃酮中主要黃酮苷類及其苷元的吸