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文檔簡介
1、乙型腦炎病毒屬于黃病毒科,黃病毒屬,主要由蚊蟲傳播,臨床上可以引起嚴重的病毒性腦炎癥狀。乙型腦炎主要流行于東南亞地區(qū),但近些年來該病的流行區(qū)域不斷擴大,現已擴展到日本和澳大利亞等地區(qū)。全球每年約有35,000~50,000乙腦病例報告,其中約10,000~15,000人死亡,幸存者中約30%~50%的病人留下不可逆的神經系統(tǒng)癥狀和認知障礙等精神疾病。盡管目前針對乙型腦炎病毒有相應的疫苗進行接種預防,但它的高致死性及區(qū)域擴散性依然引起國際
2、社會的廣泛關注。
乙型腦炎病毒為單股正鏈RNA病毒,基因組長度約為11,000nt,包括5'非編碼序列(5'NCR),3'非編碼序列(3'NCR)和中間的單一開放閱讀框(ORF)。ORF可以編碼三種結構蛋白C,prM,E以及七種非結構蛋白NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5。病毒基因組5'端有I型帽子結構(m7GpppAmG)但是其3'端缺少多聚腺苷酸poly(A)尾巴。帽子結構對于mRNA的轉運,翻
3、譯以及穩(wěn)定性至關重要。
mRNA的加帽過程一般需要四種酶,分別是RNA三磷酸酶,鳥苷酸轉移酶,N7和2'-O甲基轉移酶。由于黃病毒在宿主細胞質中復制,不能利用宿主的N7和2'-O甲基轉移酶,因此進化出了自己的甲基轉移酶系統(tǒng)。黃病毒NS5蛋白的N端具有甲基轉移酶活性,可以催化病毒RNA帽子結構的N7和2'-O甲基化。目前對于黃病毒甲基轉移酶以及病毒RNA帽子甲基化的了解主要來自于對西尼羅病毒和登革病毒的研究,但是乙型腦炎病毒的相
4、關研究卻較為滯后,其甲基轉移酶體外活性分析方法也尚未建立。因此本研究的目的是建立乙腦病毒N7和2'-O甲基轉移酶體外活性分析體系,并篩選出對甲基轉移酶活性具有影響的關鍵位點,進而測定2'-O甲基轉移酶功能缺失對于病毒生物學特征的影響,最后探索將2'-O甲基轉移酶功能缺陷型乙腦病毒作為減毒活疫苗候選株的可行性。
1.乙腦病毒甲基轉移酶體外活性分析方法的建立及酶活性關鍵位點篩選
為了建立乙腦病毒甲基轉移酶體外活性分析方法
5、,首先我們在大腸桿菌中重組表達并純化了乙腦病毒的甲基轉移酶蛋白,純化后的重組蛋白大小約為35kDa,純度大于95%。然后我們通過PCR和體外轉錄獲得乙腦病毒5'UTR起始190nt的pppA-RNA,將其作為加帽反應的底物。繼而利用牛痘病毒的加帽酶系統(tǒng)對pppA-RNA進行加帽,獲得G*pppA-RNA或者m7G*pppA-RNA(*表示后面的第一個P被放射性標記)分別作為N7和2'-O甲基化反應的底物。在登革病毒甲基轉移酶活性測定方法
6、的基礎上,我們對乙腦病毒RNA的N7和2'-O甲基化反應的鹽離子濃度,溫度,時間等條件進行優(yōu)化,建立了測定乙腦病毒N7和2'-O甲基轉移酶體外活性的最佳反應條件和分析方法。在此基礎上,我們通過定點突變的方法測定NS5蛋白K61-D146-K182-E218四分體氨基酸位點突變對于乙腦病毒N7和2'-O甲基轉移酶功能的影響。結果顯示,乙腦病毒NS5蛋白的K61A,D146A,K182A,E218A位點突變均會完全破壞2'-O甲基轉移酶功能
7、,而對于N7甲基轉移酶活性,除D146A完全破壞外,其它三個突變位點K61A,K182A和E218A均保留了部分N7甲基轉移酶活性。這些結果表明K61,D146,K182和E218位點對于乙腦病毒2'-O甲基轉移酶執(zhí)行其功能是必需的,而D146對N7甲基轉移酶執(zhí)行其功能是必需的。
2.2'-O甲基轉移酶功能缺失對乙腦病毒生物學特征的影響
為了研究2'-O甲基轉移酶功能的缺失對于乙腦病毒生物學特征的影響,我們通過定點突
8、變的方法將K61A,D146A,K182A和E218A分別引入到乙腦病毒全長感染性克隆的質粒上,經線性化和體外轉錄后,我們將病毒轉錄體RNA轉染BHK-21細胞,最終獲得了K61A和E218A兩株2'-O甲基轉移酶功能缺陷型重組乙腦病毒(D146A,K182A致死)。進而,我們測定了突變型和野生型乙腦病毒的生物學特征,包括病毒蛋白的表達,噬斑形態(tài),在細胞上的增殖特征,基因組的遺傳穩(wěn)定性,在小鼠中的神經毒力和神經侵襲力以及對干擾素和IFI
9、T(IFNinducedproteinswithtetra-tricopeptiderepeats)的敏感性等。結果發(fā)現,在轉染等量病毒RNA的BHK-21細胞中,突變病毒E蛋白的表達水平與野生型相當;突變病毒的噬斑遠小于野生型;突變病毒在多種細胞系中均可以良好的復制,復制效率略低于野生型;突變病毒具有良好的遺傳穩(wěn)定性;突變病毒在小鼠上喪失神經侵襲力,并且神經毒力較野生型病毒明顯降低;小鼠感染突變病毒后無病毒血癥出現,同時突變病毒在小鼠
10、顱內的復制效率降低;突變病毒在神經細胞上的增殖能力與野生型相比降低;機制上,我們發(fā)現突變病毒對干擾素和IFIT的抗病毒作用與野生型病毒相比更為敏感。綜上,2'-O甲基轉移酶功能缺失使乙腦病毒顯示出良好的減毒特征,而這種減毒特征可能與突變病毒對宿主干擾素以及IFIT的抗病毒作用更為敏感有關。
3.2'-O甲基轉移酶功能缺陷型乙腦病毒的免疫原性和免疫保護性研究
為了探索將2'-O甲基轉移酶功能缺陷型乙腦病毒作為減毒活疫苗
11、候選株的可行性,我們繼而對其免疫原性和免疫保護性進行了研究。將104PFU的重組突變病毒以皮下注射方式免疫BALB/c小鼠,在免疫后的二周和四周分別采血并測定血清中IgG抗體及JEV特異性中和抗體水平,同時測定誘導產生的細胞免疫水平。結果發(fā)現,單次免疫即可誘導小鼠產生高水平的IgG抗體以及JEV特異的中和抗體,其中免疫四周后的中和抗體滴度高達1∶97。同時脾細胞增殖和IFN-γ產生實驗結果說明,重組病毒免疫還可以誘導產生一定的細胞免疫。
12、為了驗證免疫的效果,我們用致死劑量的異型的野生型乙腦病毒感染免疫后的小鼠,結果發(fā)現,PBS對照組的小鼠全部死亡,而重組突變病毒免疫組的小鼠全部存活。這說明2'-O甲基轉移酶功能缺陷型乙腦病毒單次免疫即可對小鼠產生完全保護。
綜上所述,本研究建立了乙型腦炎病毒N7和2'-O甲基轉移酶體外活性分析體系,在此基礎上測定了保守關鍵位點突變對甲基轉移酶功能的影響以及2'-O甲基轉移酶功能缺失對于病毒生物學特征的影響。這些研究完善了我們對
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