MDSC誘導(dǎo)CD19hiFcγRⅡbhi調(diào)節(jié)性B細(xì)胞產(chǎn)生及其機(jī)制研究.pdf

1、髓系抑制性細(xì)胞(MDSC)是一群具有很強(qiáng)免疫抑制功能的細(xì)胞，在腫瘤和炎癥等疾病的進(jìn)展和轉(zhuǎn)歸過(guò)程中起著重要調(diào)節(jié)作用。但以往的研究主要集中于它們對(duì)T細(xì)胞和NK等細(xì)胞免疫應(yīng)答的調(diào)控作用。它們對(duì)于B細(xì)胞的功能調(diào)控作用還不是十分清楚，尤其是對(duì)于調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的分化調(diào)控作用目前尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究主要圍繞MDSC對(duì)調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的分化調(diào)控及相關(guān)的機(jī)制進(jìn)行了探討。
　　第一部分:MDSC誘導(dǎo)高分泌IL-10的B細(xì)胞產(chǎn)生
　　為了探討MDS

2、C能否誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的分化，我們將小鼠MDSC與不同刺激劑活化的B細(xì)胞（anti-IgM、可溶性CD40L、LPS）共培養(yǎng)，檢測(cè)共培養(yǎng)后上清中IL-10的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LPS刺激后的B細(xì)胞與MDSC共培養(yǎng)后其上清中IL-10的分泌水平明顯增高。接著我們通過(guò)胞內(nèi)染色的方法分別檢測(cè)了共培養(yǎng)前后B細(xì)胞及MDSC胞內(nèi)IL-10表達(dá)水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)之后B細(xì)胞胞內(nèi)IL-10的表達(dá)水平明顯增高，而MDSC共培養(yǎng)前后IL-10的表達(dá)

3、沒(méi)有明顯變化。隨后我們將共培養(yǎng)體系中的MDSC與B細(xì)胞通過(guò)流式分選出來(lái)，分別提取其總RNA，利用qRT-PCR的方法檢測(cè)其IL-10的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)體系中的IL-10主要來(lái)源于B細(xì)胞。進(jìn)一步的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該群高分泌IL-10的B細(xì)胞表達(dá)獨(dú)特表型即CD19hiFcγRⅡbhi。此外，我們通過(guò)流式分選出不同亞群的MDSC(粒系及單核系MDSC)，將其分別與LPS活化B細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)不論是粒系MDSC還是單核系MDSC均能誘導(dǎo)LPS活化

4、B細(xì)胞高分泌IL-10。另外，我們分選出脾臟不同亞群的B細(xì)胞，經(jīng)LPS活化后分別與MDSC共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)MDSC誘導(dǎo)后，T1，T2，T3及MZB細(xì)胞均能夠高分泌IL-10。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，我們將CFSE標(biāo)記的LPS活化B細(xì)胞，單獨(dú)或與MDSC共同尾靜脈注射小鼠，取小鼠脾臟，流式胞內(nèi)染色法檢測(cè)CFSE+B細(xì)胞分泌IL-10的情況，發(fā)現(xiàn)在與MDSC共注射的情況下，B細(xì)胞分泌IL-10的水平增強(qiáng)。以上結(jié)果說(shuō)明:MDSC能夠誘導(dǎo)高分泌IL-

5、10的CD19hiFcγRⅡbhiB細(xì)胞產(chǎn)生。
　　第二部分:MDSC的CD19hiFcγRⅡbhi調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的功能及其機(jī)制研究
　　為了研究MDSC誘導(dǎo)產(chǎn)生的高分泌IL-10的具有CD19hiFcγRⅡbhi表型的B細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞是否具有調(diào)節(jié)功能，我們先通過(guò)流式將MDSC與B細(xì)胞共培養(yǎng)體系中CD19hiFcγRⅡbhi及CD19lowFcγRⅡblowB細(xì)胞分選出來(lái)，分別與帶有CFSE標(biāo)記且經(jīng)抗CD3/CD28活化的CD4

6、+T細(xì)胞共培養(yǎng)，3天以后檢測(cè)T細(xì)胞增殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD19hiFcγRⅡbhiB細(xì)胞能夠明顯抑制活化的CD4+T細(xì)胞增殖，且在共培養(yǎng)體系中加入IL-10的中和性抗體后，CD4+T細(xì)胞可恢復(fù)增殖，這一結(jié)果提示CD19hiFcγRⅡbhiB細(xì)胞可以通過(guò)其分泌的IL-10抑制活化T細(xì)胞增殖。另外，我們檢測(cè)了CD19hiFcγRⅡbhiB細(xì)胞和CD19lowFcγRⅡblowB細(xì)胞對(duì)活化CD4+T細(xì)胞表面CD69分子表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD1

7、9hiFcγRⅡbhiB和CD19lowFcγRⅡblowB細(xì)胞對(duì)CD69的表達(dá)均沒(méi)有明顯影響，以上結(jié)果提示CD19hiFcγRⅡbhiB細(xì)胞并非通過(guò)抑制T細(xì)胞活化，而是通過(guò)抑制已活化T細(xì)胞的增殖發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。此外，我們還檢測(cè)了CD19hiFcγRⅡbhiB細(xì)胞和CD19lowFcγRⅡblowB細(xì)胞對(duì)活化CD4+T細(xì)胞分泌IL-4及IFN-γ的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（數(shù)據(jù)未顯示），CD19hiFcγRⅡbhiB和CD19lowFCγRⅡblo

8、wB細(xì)胞不能影響CD4+T細(xì)胞向Th1及Th2方向的分化。
　　在對(duì)機(jī)制的研究上，首先我們利用transwell系統(tǒng)將MDSC與B細(xì)胞隔離，共培養(yǎng)48h后檢測(cè)上清中IL-10的分泌情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MDSC誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生IL-10。此外，將MDSC培養(yǎng)上清與LPS活化B細(xì)胞共培養(yǎng)后，與單獨(dú)的LPS活化B細(xì)胞相比，IL-10的水平也沒(méi)有明顯變化。我們探索了MDSC上哪些膜分子參與誘導(dǎo)了調(diào)節(jié)性B細(xì)胞高分泌IL-10。已有研究表明:CD4

9、0L-CD40通路在調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的分化中起到著重要作用。通過(guò)流式檢測(cè)我們發(fā)現(xiàn)， MDSC表面表達(dá)CD40L分子，B細(xì)胞表面表達(dá)CD40分子，且B細(xì)胞經(jīng)LPS活化后其表面CD40的表達(dá)量增加，另外，在B細(xì)胞中加入可溶性CD40L可使其上清中IL-10的表達(dá)水平增高。下一步我們將用CD40-/-小鼠的B細(xì)胞與CD40L-/-小鼠的MDSC共培養(yǎng)，檢測(cè)上清及胞內(nèi)IL-10的分泌情況，從而明確CD40L-CD40通路在MDSC誘導(dǎo)高分泌IL-1

10、0調(diào)節(jié)性B細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)程中的作用。
　　總之，本研究發(fā)現(xiàn)粒系和單核系MDSC均能夠促進(jìn)LPS活化后的脾臟B細(xì)胞分化為高分泌IL-10的，表型為CD19hiF cγRⅡbhi的調(diào)節(jié)性B細(xì)胞，該群B細(xì)胞通過(guò)其分泌的IL-10抑制活化CD4+T的增殖。本研究提出了MDSC負(fù)向調(diào)控免疫應(yīng)答的新機(jī)制，即通過(guò)促進(jìn)調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的分化從而進(jìn)一步擴(kuò)大其獨(dú)特的免疫負(fù)向調(diào)節(jié)功能，有助于更全面地認(rèn)識(shí)MDSC對(duì)免疫應(yīng)答多細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的負(fù)向調(diào)控功能，并使我們對(duì)調(diào)節(jié)