長鏈非編碼RNA LINC01133在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的作用.pdf

1、結(jié)直腸癌是世界上最常見的威脅人類健康的惡性腫瘤之一。在所有的惡性腫瘤中，結(jié)直腸癌每年的發(fā)病率和死亡率都高居前列。在最近幾年，全世界每年都有超過60萬患者死于結(jié)直腸癌。超過90％的腫瘤患者死亡是由腫瘤轉(zhuǎn)移引起的。近年來的研究顯示:惡性腫瘤細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是惡性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要機制。EMT是指細胞在內(nèi)部因素和外界環(huán)境的綜合作用下由上皮細胞表型轉(zhuǎn)變成間質(zhì)細胞的過程。通過發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，上皮來源的惡性腫瘤細胞獲得間質(zhì)細胞表型，

2、獲得了侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。那么惡性腫瘤發(fā)生EMT的分子機制又是什么呢？之前的大多數(shù)研究都是集中在對蛋白質(zhì)分子的研究上。然而蛋白質(zhì)分子所對應的mRNA在人類轉(zhuǎn)錄組中只占不到20％，超過80％的轉(zhuǎn)錄組是不能翻譯成蛋白質(zhì)的。這部分轉(zhuǎn)錄組對應的RNA就是非編碼RNA(noncoding RNA，ncRNA)。這其中大部分是長度超過200個核苷酸的長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）。lncRNA在轉(zhuǎn)錄組中占據(jù)了絕

3、大部分，它們必將會發(fā)揮著不可替代的功能，否則數(shù)目眾多的lncRNA對細胞就會是一種負擔，與進化過程中生命對使用物質(zhì)和能量節(jié)約原則相悖。所以lncRNA在調(diào)控結(jié)直腸癌發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中也很可能發(fā)揮著重要作用。
　　我們選用TGF-β刺激結(jié)直腸癌細胞來構(gòu)建誘導EMT發(fā)生的模型。然后將TGF-β處理的結(jié)直腸癌細胞作為實驗組，將未處理的結(jié)直腸癌細胞作為對照組。為了鑒定出參與結(jié)直腸癌發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中的lncRNA，我們對兩組細胞做

4、了轉(zhuǎn)錄組微矩陣芯片分析。從中鑒定出了差異表達的長lncRNA LINC01133。LINC01133在TGF-β誘導EMT過程中表達顯著下調(diào)。于是我們選擇LINC01133作為研究對象來研究其在結(jié)直腸癌EMT和轉(zhuǎn)移中的作用，并得出了以下結(jié)論:
　　一、 LINC01133的表達受到TGF-β的抑制。
　　得到芯片結(jié)果之后，我們重復了TGF-β刺激構(gòu)建結(jié)直腸癌細胞EMT模型試驗。并通過q-RTPCR對芯片結(jié)果做了驗證，證明LI

5、NC01133的表水平確實能被TGF-β下調(diào)。并且當阻斷TGF-β受體或者通過沉默TGF-β通路下游的smad2后，LINC01133的表達水平又能恢復。結(jié)果表明LINC01133是受TGF-β抑制的一條長鏈非編碼RNA。
　　二、LINC01133抑制結(jié)直腸癌細胞EMT和轉(zhuǎn)移。
　　為了研究長鏈非編碼RNA LINC01133在結(jié)直腸癌細胞發(fā)生EMT和轉(zhuǎn)移中的作用。我們使用小干擾RNA在高表達LINC01133的結(jié)直腸癌細

6、胞中的敲低LINC01133表達水平，在低表達LINC01133的結(jié)直腸癌細胞HCT116中過表達LINC01133。當LINC01133被敲低后，結(jié)直腸癌細胞的遷移侵襲能力增強，上皮標志物E-cadherin表達水平下調(diào)，間質(zhì)標志物Fibronectin、Twist表達上調(diào);LINC01133過表達后，結(jié)直腸癌細胞的遷移侵襲能力減弱，上皮標志物E-cadherin表達水平上調(diào)，間質(zhì)標志物Fibronectin表達下調(diào)。同時小鼠尾靜脈注

7、射肺轉(zhuǎn)移模型顯示，LINC01133敲低后結(jié)直腸癌細胞的轉(zhuǎn)移能力增強。同時結(jié)直腸癌臨床樣本研究表明LINC01133在腫瘤組織中表達明顯下調(diào)，腫瘤組織中LINC01133表達水平高的患者遠處轉(zhuǎn)移率低，生存預后好，并且腫瘤組織中LINC01133表達水平與E-cadherin呈正相關(guān)，與Vimentin呈負相關(guān)。以上結(jié)果表明L1NC01133可以抑制結(jié)直腸癌發(fā)生EMT和轉(zhuǎn)移。
　　三、LINC01133與SRSF6相結(jié)合并且可能通過

8、阻斷SRSF6促EMT的作用來抑制結(jié)直腸癌EMT和轉(zhuǎn)移
　　(1)鑒定LINC01133的結(jié)合蛋白SRSF6。
　　我們通過改良ChIRP實驗結(jié)合質(zhì)譜鑒定出LINC01133的結(jié)合蛋白SRSF6。并通過Western Blot實驗用SRSF6的抗體進行了驗證。此外，又通過RIP反向驗證SRSF6蛋白對LINC01133的結(jié)合作用。經(jīng)過正反兩方面的驗證，我們確認長鏈非編碼RNA LINC01133和SRSF6蛋白有相互作用。<

9、br>　　(2) SRSF6促進結(jié)直腸癌細胞發(fā)生EMT和轉(zhuǎn)移。
　　在鑒定出LINC01133的結(jié)合蛋白SRSF6之后，我們又驗證了SRSF6對結(jié)直腸癌的EMT和轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用。我們在高表達LINC01133的HT29細胞系、低表達LINC01133的HCT116細胞系和不表達LINC01133的SW620細胞系中利用慢病毒介導的shRNA將SRSF6干擾敲低。我們發(fā)現(xiàn)當SRSF6表達水平敲低以后，結(jié)直腸細胞的遷移侵襲能力減弱，上

10、皮標志物E-cadherin表達水平上調(diào)，間質(zhì)標志物Fibronectin、Twist表達下調(diào);LINC01133過表達后，結(jié)直腸細胞的遷移侵襲能力減弱，上皮標志物E-cadherin表達水平表達上調(diào)，間質(zhì)標志物Vimentin、Fibronectin等表達下調(diào)。以上結(jié)果表明SRSF6可以不依賴于LINC01133，單獨地促進結(jié)直腸癌細胞EMT和轉(zhuǎn)移。
　　(3) LINC01133對結(jié)直腸癌細胞EMT和轉(zhuǎn)移的抑制用依賴于SRSF

11、6
　　我們通過實驗驗證LINC01133對結(jié)直腸癌細胞EMT過程的調(diào)控作用是否依賴于SRSF6。當SRSF6的表達被敲低后，LINC01133對EMT相關(guān)的蛋白標志物的調(diào)控以及對結(jié)直腸癌細胞遷移能力的調(diào)控作用都減弱了。結(jié)果提示我們長鏈非編碼RNA LINC01133對結(jié)直腸癌發(fā)生EMT和轉(zhuǎn)移的抑制作用依賴于其與SRSF6結(jié)合和對SRSF6促EMT功能的阻斷。
　　綜合以上結(jié)果可以得出結(jié)論:長鏈非編碼RNA LINC0113