膠質瘤細胞與人腦微血管內皮細胞之間ERK的作用機制.pdf

1、目的：
　　神經(jīng)膠質瘤是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中為最常見的，也是最難治愈的惡性腫瘤，起源于神經(jīng)外胚層的中樞神經(jīng)惡性原發(fā)腫瘤，約占顱內腫瘤的35.26％-60.96%，占成人所有惡性腫瘤的2%，是一種嚴重危害著人體健康的常見惡性疾病。在膠質瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，具有浸潤性生長、侵襲性強、易復發(fā)、血管豐富等生物學特征，而一般認為，正是膠質瘤的這種高侵襲性、富血管化等以及它與血管內皮細胞之間的一些相互作用而導致神經(jīng)膠質瘤難根治、愈后差、易復發(fā)等。

2、神經(jīng)膠質瘤細胞與血管內皮細胞之間的相互作用能夠促進膠質瘤的侵襲性生長，但是具體機制尚不十分明確。因此，研究人腦微血管內皮細胞和神經(jīng)膠質瘤細胞之間的相互作用具有很重要的現(xiàn)實意義。神經(jīng)膠質瘤作為人類顱內最常見的惡性腫瘤，其本質上是一種多基因參與，并且多基因異常的疾病。多數(shù)研究結果顯示，ERK/MAPK信號轉導通路是目前與神經(jīng)膠質瘤相關的主要的信號轉導通路之一，與神經(jīng)膠質瘤的發(fā)病機制、發(fā)展過程及其生物學行為有著密切的關系。在本實驗中，我們擬通

3、過觀察血管內皮細胞分泌因子EGF對膠質瘤細胞的增殖能力及侵襲能力等生物學行為的影響，以及ERK信號通路相關因子反過來對血管內皮細胞的影響來探討二者之間的相互作用及相關機制。
　　方法：
　　探討血管內皮細胞分泌因子EGF對神經(jīng)膠質瘤細胞生物學行為的影響。體外培養(yǎng)神經(jīng)膠質瘤細胞系U87MG、U251，以及微血管內皮細胞HBMEC，建立神經(jīng)膠質瘤細胞與血管內皮細胞二者之間的共培養(yǎng)體系；應用ERK信號通路激動劑EGF和抑制劑PD9

4、8059處理人神經(jīng)膠質瘤細胞U87MG和U251，觀察ERK的活性改變時對細胞增殖、侵襲及擬血管形態(tài)的影響。按實驗要求將細胞分組，分別為神經(jīng)膠質瘤細胞單獨培養(yǎng)組，二者共培養(yǎng)組，加入外源性EGF組和加入PD98059組。分別采取CCK-8法檢測神經(jīng)膠質瘤細胞的增殖能力，Transwell侵襲法檢測神經(jīng)膠質瘤細胞的侵襲能力，擬血管形態(tài)實驗檢測神經(jīng)膠質瘤細胞的擬血管形態(tài)形成的能力，Western Blots法檢測神經(jīng)膠質瘤細胞P-ERK的活化

5、。
　　探討神經(jīng)膠質瘤細胞分泌的VEGF對血管內皮細胞生物學行為的影響以及EGF的分泌量的影響。按實驗的不同要求將細胞分組，分別為HBMEC單獨培養(yǎng)組，HBMEC與神經(jīng)膠質瘤細胞共培養(yǎng)組。ELISA法檢測不同情況下血管內皮細胞EGF的分泌量，血管生成實驗檢測不同情況下HBMEC血管生成的情況。
　　結果：
　?、俳Y果顯示，與對照組相比，與HBMEC共培養(yǎng)組神經(jīng)膠質瘤細胞的增殖能力明顯增強。加入50ng/mL的外源性EG

6、F時，增殖能力明顯增強。而加入5μM/L PD98059時，增殖能力明顯降低。（p<0.05）
　　②與對照組相比（侵襲數(shù)目為105.33±6.110），與HBMEC共培養(yǎng)組U87MG的侵襲能力明顯增強（侵襲數(shù)目為261.67±10.214），U87MG加入50ng/mL EGF組細胞襲能力明顯增強（侵襲數(shù)目為214.33±11.150）。而U87MG加入5μM/L PD98059細胞侵襲能力明顯降低（侵襲數(shù)目為55.67±6.0

7、28）。U251細胞也表現(xiàn)出相似的結果，對照組、共培養(yǎng)組、加入EGF組、加入PD98059組細胞侵襲的數(shù)目分別為77.33±6.658、237.00±10.440、191.33±3.215、50.67±4.509。（p<0.05）
　?、叟c對照組相比(管腔直徑：130.112土2.022μm)，HBMEC共培養(yǎng)組U87MG相互融合，連接成網(wǎng)絡樣結構，擬血管形態(tài)形成的能力明顯增強(管腔直徑202.134土2.007μm)，U87MG

8、加入50ng/mL EGF組（223.19土2.012μm）擬血管形態(tài)形成的能力也明顯增強，而加入5UM/L PD98059組（76.199土2.833μm）細胞生長較為紊亂，擬血管形態(tài)管腔明顯變小。U251細胞也顯示出相似的結果，對照組、共培養(yǎng)組、加入EGF組、加入PD98059組細胞侵襲的數(shù)目分別為：90.122土2.733μm、230.112土2.662μm、143.2262.098μm、44.039土1.092μm。（p<0.0

9、5）
　?、芤訥APDH為內參，結果顯示，與HBMEC共培養(yǎng)組P-ERK的表達明顯增強。加入50ng/mLEGF組P-ERK的表達也相對增強。而加入5μM/L PD98059組P-ERK的表達明顯降低。（p<0.05）
　　⑤結果顯示，HBMEC加入不同濃度的VEGF165時，EGF的分泌量不斷的增加。HBMEC與兩種神經(jīng)膠質瘤細胞共培養(yǎng)時，EGF分泌量明顯增加。（p<0.05）
　?、藿Y果顯示，與對照組相比（管腔直徑

10、：115.12土1.731μm），HBMEC與U87MG共培養(yǎng)時，血管生成的能力明顯增加，細胞之間相互融合，形成網(wǎng)絡結構，并且小管的數(shù)目及管腔直徑明顯增加（管腔直徑：245.228土1.993μm）。U251細胞也表現(xiàn)出相似的結果，管腔直徑：225.163土1.622μm。(p<0.05)
　　結論：
　　1.血管內皮細胞分泌因子EGF能夠通過RAF-MAPK-ERK信號通路增加神經(jīng)膠質瘤細胞的增殖能力，侵襲能力，擬血管形態(tài)