施萬細胞通過BDNF-TrkB信號通路促進SACC嗜神經(jīng)侵襲機制的研究.pdf

1、涎腺腺樣囊性癌（Salivary adenoid cystic carcinoma, SACC）是最常見的涎腺惡性腫瘤之一，具有嗜神經(jīng)侵襲的特性，區(qū)別于涎腺其它惡性腫瘤。最近研究發(fā)現(xiàn)腦源性神經(jīng)生長因子（Brain-derived Neurotrophic Factor, BDNF）和它的特異性受體酪氨酸激酶受體B（tropomysin-related kinase B, TrkB）在多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)過度表達。課題組前期研究表明 BDN

2、F和 TrkB在涎腺腺樣囊性癌中的呈現(xiàn)高表達，并證實了TrkB在涎腺腺樣囊性癌中的表達強度與其嗜神經(jīng)侵襲程度相關(guān)。
　　典型的EMT過程包括細胞喪失極性及細胞間黏附分子，細胞骨架重組，獲得成纖維樣細胞表型。多項研究表明，EMT在多種惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。盡管EMT與嗜神經(jīng)侵襲之間的關(guān)系罕有報道，但是我們有理由推斷，既然EMT能夠賦予腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、侵襲的能力，它在嗜神經(jīng)侵襲過程中必然發(fā)揮重要作用。越來越多的證據(jù)表明

3、，施萬細胞樣分化可能是一些神經(jīng)源性惡性腫瘤發(fā)生神經(jīng)侵襲可能機制之一，腫瘤嗜神經(jīng)侵襲現(xiàn)象可比擬為施萬細胞對神經(jīng)組織的親和力。
　　目前，關(guān)于BDNF/TrkB信號通路、EMT以及Schwann細胞樣分化之間的關(guān)聯(lián)及其在 SACC嗜神經(jīng)侵襲過程中作用的研究尚未見報道。本課題通過建立施萬細胞與SACC細胞的體外共培養(yǎng)模型，模擬SACC神經(jīng)侵襲過程中兩種細胞之間的相互作用，證明施萬細胞通過BDNF/TrkB信號通路促進SACC的EMT和S

4、chwann細胞樣分化過程，并用臨床SACC標本免疫組化實驗加以印證，探討SACC嗜神經(jīng)侵襲的可能分子機制。
　　第一部分實驗
　　目的：建立腺樣囊性癌細胞與大鼠施萬細胞共培養(yǎng)模型，探討細胞間相互作用時BDNF、TrkB的表達變化情況以及K252a對兩種細胞表達BDNF、TrkB的影響。
　　方法：采用Transwell系統(tǒng)建立腺樣囊性癌細胞與大鼠施萬細胞共培養(yǎng)模型，共培養(yǎng)72h后， ELISA法檢測各組培養(yǎng)液中BDN

5、F含量， RT-PCR、Western免疫印跡檢測兩種細胞中BDNF、TrkB表達情況以及用K252a刺激時的變化情況。采用SPSS17.0軟件包對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)處理。
　　結(jié)果：施萬細胞與SACC細胞共培養(yǎng)組的培養(yǎng)基中BDNF的濃度顯著高于它們單獨培養(yǎng)組中BDNF濃度總和；共培養(yǎng)組的施萬細胞表達BDNF的量顯著增高，而表達TrkB的量未見明顯變化；共培養(yǎng)組的SACC細胞表達TrkB的量顯著增加，而表達BDNF的量未見明顯變化

6、；TrkB抑制劑 K252a能夠顯著抑制上述改變；對照組黏液表皮樣癌細胞與施萬細胞共培養(yǎng)時未發(fā)生類似改變。
　　結(jié)論：BDNF/TrkB信號通路在施萬細胞與 SACC細胞相互作用過程中發(fā)揮重要作用，但其下游通路的分子機制有待進一步實驗研究。
　　第二部分實驗
　　目的：通過腺樣囊性癌細胞與大鼠施萬細胞共培養(yǎng)模型，研究施萬細胞通過BDNF/TrkB信號通路促進SACC細胞EMT發(fā)展及其Schwann細胞樣分化過程。

7、>　　方法：以涎腺腺樣囊性癌SACC-83細胞系為研究對象，利用RT-PCR、Western免疫印跡、免疫熒光染色等方法檢測與施萬細胞共培養(yǎng)的SACC-83細胞EMT發(fā)展及 Schwann細胞樣分化相關(guān)分子的表達變化情況，細胞攝像及激光共聚焦成像觀察SACC-83細胞形態(tài)學(xué)變化，劃痕實驗及Transwell嗜神經(jīng)侵襲實驗觀察腫瘤細胞運動能力及神經(jīng)侵襲能力的變化，并通過K252a阻斷BDNF/TrkB信號通路觀察對其EMT發(fā)展及Schwa

8、nn細胞樣分化的影響。采用SPSS17.0軟件包對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)處理。
　　結(jié)果：與單獨培養(yǎng)的SACC-83細胞相比，共培養(yǎng)組的SACC-83細胞形態(tài)由橢圓形變?yōu)榧忓N形及多角形，細胞間連接消失，EMT標志分子E-cadherin表達下調(diào)， N-cadherin、Vimentin表達上調(diào)，腫瘤細胞運動能力及嗜神經(jīng)侵襲能力明顯增強，同時共培養(yǎng)組的腫瘤細胞表達施萬細胞標志分子S100A4、GFAP的量顯著上調(diào)；通過K252a阻斷 B

9、DNF/TrkB信號通路能夠顯著抑制 SACC-83細胞的EMT發(fā)展及Schwann細胞樣分化。
　　結(jié)論：施萬細胞能夠通過 BDNF/TrkB信號通路促進 SACC細胞的EMT發(fā)展及Schwann細胞樣分化，腫瘤-神經(jīng)之間的相互作用可能是SACC嗜神經(jīng)侵襲的可能機制之一。
　　第三部分實驗
　　目的：研究TrkB、E-cadherin和S100A4在涎腺腺樣囊性癌組織中的表達及其與SACC臨床嗜神經(jīng)侵襲之間的關(guān)聯(lián)。<

10、br>　　方法：采用免疫組化染色檢測187例涎腺腺樣囊性癌和20例正常涎腺組織中TrkB、E-cadherin和S100A4的表達情況，并分析其與SACC臨床嗜神經(jīng)侵襲之間的關(guān)聯(lián)。采用SPSS17.0軟件包對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)處理。
　　結(jié)果：與正常涎腺組織相比，SACC侵犯的外周神經(jīng)組織周圍，TrkB、S100A4的染色強度顯著增高，E-cadherin的染色強度顯著減弱，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義；SACC標本中 TrkB以及 S10