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文檔簡介
1、背景:
2型糖尿?。═2DM)是一種嚴重危害人類健康的慢性非傳染病,主要特點為胰島素抵抗、β細胞功能障礙及高血糖,可誘發(fā)眼、心、腎、血管和神經(jīng)系統(tǒng)等多種組織器官的并發(fā)癥。T2DM由遺傳因素、環(huán)境因素以及行為因素共同作用導致,發(fā)病機制復雜。胰島素抵抗是T2DM的主要病理生理機制及治療難點。大量的文獻及本實驗室的研究表明,氧化應激在胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。此外,線粒體損傷是胰島素抵抗發(fā)生的關鍵機制。線粒體是細胞內生成
2、 ROS的主要部位,也是ROS誘發(fā)氧化損傷的主要靶點。然而,氧化應激與線粒體損傷在胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展過程中的相互作用及分子機制還不清楚。
Nrf2是一種關鍵的抗氧化核心轉錄因子,通過調節(jié)一系列抗氧化酶的轉錄發(fā)揮作用。轉錄因子 NRF-1通過調節(jié) mtTFA,在調控線粒體生物發(fā)生中發(fā)揮關鍵作用。文獻報道,Nrf2對NRF-1的轉錄、線粒體生物發(fā)生及心肌保護有一定調控作用。然而,在胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展過程中,Nrf2和NRF-1是否
3、存在相互作用還有待研究。
本課題通過高脂飲食飼喂構建胰島素抵抗動物模型,研究在胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展過程中,氧化應激、線粒體結構、功能及關鍵分子Nrf2和NRF-1、mtTFA等的變化特點;研究T2DM模式動物db/db鼠關鍵分子Nrf2、NRF-1、mtTFA變化特點;并在L02人正常肝細胞系中,通過轉染pCDNA3-Myc3-Nrf2質粒,研究Nrf2對抗氧化酶及NRF-1、mtTFA等分子的調控機制。研究結果試圖為發(fā)現(xiàn)新的胰
4、島素抵抗發(fā)病機制提供有價值的基礎資料,為制定有效的干預措施提供重要的實驗與理論依據(jù)。
目的:
1.研究高脂飲食飼喂誘導胰島素抵抗、肝脂肪變、氧化應激及線粒體損傷的動態(tài)變化特點。
2.研究胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展過程中Nrf2、NRF-1、mtTFA的動態(tài)改變。
3.研究Nrf2、NRF-1、mtTFA動態(tài)改變介導胰島素抵抗的分子機制。
方法:
1.高脂飲食飼喂構建胰島素抵抗動物模型:
5、采用含10%脂肪的高脂飲食飼喂,第8周和第12周測定葡萄糖/胰島素耐量,第16至28周每4周測定葡萄糖/胰島素耐量及其他分子生物學指標。
2.胰島素敏感性相關指標測定:動物禁食過夜,使用Roche血糖儀、血糖試紙測定空腹血糖;腹腔注射葡萄糖(1 g·kg-1)/胰島素(0.75 IU·kg-1),測定葡萄糖/胰島素耐量;取血清,使用 ELISA試劑盒測定胰島素含量;計算 HOMA-IR;處死前30 min腹腔注射胰島素(10
6、IU·kg-1)測定胰島素信號。
3.肝臟形態(tài)學指標檢測:油紅 O染色觀察肝脂肪變程度;天狼猩紅-苦味酸染色觀察肝纖維化。
4.氧化應激相關指標測定:活性氧熒光探針DHE檢測ROS;試劑盒檢測MDA、GSSG/GSH及抗氧化酶活性。
5.線粒體相關指標測定:透射電鏡觀察線粒體結構變化;液相氧電極檢測耗氧量。
6.細胞模型構建:在L02細胞系中轉染pCDNA3-Myc3-Nrf2質粒,過表達Nrf2
7、。
7.關鍵分子測定:Western Blot檢測Nrf2、NRF-1、mtTFA、P-Akt、SREBP1c及多種抗氧化酶表達水平。
結果:
1.高脂IR動物葡萄糖耐量第12周起受損,血糖、胰島素依次升高,第24周發(fā)生胰島素耐量受損,胰島素信號分子P-Akt第20周起降低,HOMA-IR始終升高;db/db鼠血糖、HOMA-IR升高,胰島素降低。
2.高脂IR動物肝脂肪變、肝纖維化逐漸加重,脂質
8、合成關鍵轉錄因子SREBP1c表達第20-24周升高,第28周降至對照水平;db/db鼠發(fā)生嚴重肝脂肪變,SREBP1c顯著升高。
3.高脂IR動物肝臟ROS水平第16周升高,第24周后降低,MDA含量升高,抗氧化酶表達第16周升高,第28周降低;db/db鼠肝MDA、GSSG/GSH升高,CAT、SOD活性升高,GPx活性降低、表達升高,其余抗氧化酶表達無顯著改變; L02細胞轉染質粒80 h后抗氧化酶表達升高。
9、4.高脂IR動物肝線粒體第16周起形態(tài)異常,逐漸加重;耗氧量第16周升高,第20周降低。
5.高脂IR動物Nrf2(100 kD)第16-20周升高,第24-28周降低,Nrf2(61 kD)、NRF-1、mtTFA降低;db/db鼠Nrf2(100 kD)無顯著變化,Nrf2(61 kD)、NRF-1、mtTFA降低;L02細胞轉染質粒80 h后Nrf2(100 kD)升高,Nrf2(61 kD)、NRF-1、mtTFA無顯
10、著變化。
結論:
1.肝脂肪變、氧化應激及線粒體損傷在高脂飲食誘導的胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展中逐漸加重。
2.Nrf2、NRF-1、mtTFA在高脂飲食誘導的胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展中存在動態(tài)變化,并與肝脂肪變、氧化應激及線粒體損傷密切相關。
3.與野生型小鼠相比,T2DM模式動物db/db鼠存在Nrf2、NRF-1、mtTFA改變。
4.過量ROS通過抑制Nrf2(100 kD),削弱抗氧化防御系
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