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文檔簡介
1、目的:
P311是于1993年首次在晚期胚胎小鼠的腦組織中發(fā)現(xiàn),P311基因表達產(chǎn)生約8kDa大小的胞漿蛋白,因其N末端存在PEST結(jié)構(gòu)域,較易被Met-HGF-SF、泛素-蛋白酶及金屬蛋白酶等多條通路降解致其生物半衰期較短。成年人正常組織中并無P311表達,P311主要存在于神經(jīng)細胞、平滑肌細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、軟骨細胞中,已有研究表明,P311在促進神經(jīng)組織修復(fù)、創(chuàng)面愈合、腫瘤血管形成、胚胎發(fā)育,維持血壓平衡等方面發(fā)揮著重要
2、作用。然而P311蛋白質(zhì)分子量較小且表達極不穩(wěn)定,這限制了對P311結(jié)構(gòu)及功能的深入研究。因而迄今尚不完全明確P311的確切生物學功能及其轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)機制,也未能將其歸入到某一特定類型的蛋白質(zhì)家族當中。
本研究旨在通過在體外條件下模擬缺氧環(huán)境,初步研究缺氧(1%O2濃度)及常氧環(huán)境下野生型及同屬來源P311-/-新生小鼠EpSC在不同時相點的劃痕遷移速率,以及缺氧環(huán)境下野生型EpSC中HIF-1α與P311之間的相互作用。劃痕
3、實驗結(jié)果表明,缺氧早期,同種細胞缺氧條件下遷移速率較常氧條件下更快;同時,相同時相點P311-/-來源EpSC較野生型小鼠EpSC遷移速率更慢;實時熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果提示,缺氧條件下,表皮干細胞中HIF-1α及P311mRNA水平均明顯升高。同時,HIF-1α抑制后,P311mRNA表達水平明顯下降。免疫印跡實驗及免疫細胞化學實驗結(jié)果顯示缺氧早期HIF-1α及P311蛋白表水平明顯上升。
綜上,缺氧條件下,EpSC中
4、P311表達增強可能受HIF-1α的轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié),P311表達能夠促進EpSC的遷移。這為下一步進行P311生物學功能及作用機理研究提供了新的思路。
方法:
1.HIF-1α與P311在缺氧促進表皮干細胞遷移中的作用
1)表皮干細胞的培養(yǎng)及鑒定
乙醚吸入麻醉新生小鼠,頸椎脫臼處死,滅菌后仔細分離皮膚組織,兩步酶法及Ⅳ型膠原蛋白快速黏附法提取表皮干細胞,定期換液并觀察細胞生長情況。
2)表
5、皮干細胞的流式鑒定
取首次傳代EpSC,待細胞生長至70%左右融合時,用抗小鼠CD71及CD49f雙抗孵育,流式細胞儀檢測兩種標志物CD71(-)/CD49f(+)的細胞百分比。
3)劃痕實驗檢測缺氧對表皮干細胞遷移
首次傳代細胞待生長融合至70%左右時,絲裂霉素C5μg/mL常溫常氧處理2h抑制其增殖,SPSS隨機分組。實驗分兩部分進行:第一部分,檢測野生型常氧組、P311-/-常氧組、野生型缺氧組、P3
6、11-/-缺氧組各組EpSC在劃痕即刻、12h、24h、48h后劃痕愈合剩余寬度;第二部分,檢測野生型缺氧組、野生型缺氧DMSO組、野生型HIF-1α抑制劑組、野生型HIF-1α穩(wěn)定劑組各組在劃痕即刻、12h、24h、48h后劃痕愈合剩余寬度,每組每時相點設(shè)三個插件。結(jié)果以均數(shù)±標準差表示,析因設(shè)計方差分析與單因素方差分析比較組間差異,P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。
2.在EpSC缺氧中HIF-1α對P311的影響
7、1)免疫印跡檢測EpSC中HIF-1α的表達情況
分別取處于對數(shù)生長期第1代野生型及P311-/-小鼠EpSC,SPSS法隨機分組,在缺氧0h、12h、24h、48h后應(yīng)用磷酸化蛋白提取試劑盒提取總蛋白,用SDS-PAGE法進行免疫印跡實驗檢測EpSC中HIF-1α蛋白表達水平,凝膠成像儀下成像,Quantity one凝膠定量軟件分析灰度值,將灰度值與內(nèi)參β-Tublin進行比較,結(jié)果以比值表示。各時相點之間的比較采用單因素
8、方差分析,P<0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。
2)實時熒光定量RT-PCR檢測HIF-1α對P311mRNA在EpSC中表達的影響
SPSS隨機分組,野生型缺氧對照組、野生型缺氧DMSO組、野生型HIF-1α抑制劑組、野生型HIF-1α穩(wěn)定劑組EpSC缺氧處理0、12、24、48h后用TRNzol法提取總RNA,用紫外分光光度儀檢測RNA濃度及純度,進行實時熒光定量RT-PCR法檢測P311與HIF-1αmRNA的
9、表達量,以GAPDH為內(nèi)參,△循環(huán)閡值(Ct)法處理結(jié)果,2-△△Ct即為mRNA相對表達量,總體比較采用析因設(shè)計及單因素方差分析,兩兩比較采用LSD分析,P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。
3)免疫細胞化學實驗檢測HIF-1α對P311在EpSC中表達的影響
同樣SPSS隨機分組,光學顯微鏡檢測野生型缺氧組、野生型缺氧DMSO組、野生型HIF-1α抑制劑組、野生型HIF-1α穩(wěn)定劑組缺氧處理0、12、24、48h后Ep
10、SC中P311表達(棕色顆粒為陽性)情況。每張圖片取5個視野觀察,圖片導入Image ProPlus6.0進行分析,結(jié)果用積分吸光光度值表示??傮w比較采用析因設(shè)計及單因素方差分析,兩兩比較采用LSD分析,P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。
3.熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測HIF-1α對P311轉(zhuǎn)錄激活作用
首先對P311啟動子序列利用KOD-plus高保真酶進行PCR體外擴增,構(gòu)建P311啟動子表達質(zhì)粒。待HEK-293細胞
11、生長融合至約90%,瞬時轉(zhuǎn)染細胞,pGL3/basic-空載缺氧組、pGL3/basic-P311常氧組、pGL3/basic-P311缺氧組、pGL3/basic-P311-HIF-1α抑制劑組在處理即刻、12、24、48h后提取總蛋白并檢測熒光素酶活性。以pGL3/basic-P311常氧組即刻為對照,總體比較采用析因設(shè)計及單因素方差分析,兩兩比較采用LSD分析,P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。
結(jié)果:
1.P31
12、1及HIF-1α在缺氧促進表皮干細胞遷移中的作用
1)表皮干細胞純化及鑒定
所提取表干皮細胞經(jīng)純化、流式鑒定后發(fā)現(xiàn)CD71(-)/CD49f(+)細胞占87%左右;倒置相差光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細胞呈鋪路石樣生長,單個細胞呈規(guī)則多邊形,細胞體積較小,核質(zhì)比較大,立體感較強,符合EpSC的特征。
2)缺氧條件下P311及HIF-1α對表皮干細胞遷移的影響
與野生型缺氧組比較,P311-/-EpSC常氧
13、及缺氧、野生型HIF-1α抑制劑組12、24h劃痕剩余寬度明顯較寬;野生型HIF-1α穩(wěn)定劑組12、24h劃痕剩余寬度明顯變小,P值均<0.05,差異有統(tǒng)計學意義。7組間48h總體比較無差異,(F=19.02,P>0.05).
2.在EpSC缺氧中HIF-1α對P311表達的影響
1)免疫印跡實驗檢測HIF-1α在EpSC中的表達
免疫印跡實驗結(jié)果表明,與常氧條件下相比,缺氧12h后野生型及P311-/-E
14、pSC中HIF-1α表達至較高水平,24h開始下降,48h與常氧無明顯差異。野生型小鼠表皮干細胞缺氧0、12、24、48h的HIF-1α蛋白表達分別為1.02±0.05、2.56±0.09、1.60±0.17、1.17±0.03,總體比較差異明顯(F=48.30,P<0.05)。與缺氧0h比較,缺氧12h后HIF-1α蛋白表達明顯增強(P<0.01),缺氧24h開始下降但仍高于缺氧0h(P<0.05),缺氧48h后降至常氧水平(P>0.
15、05).
2)實時熒光定量RT-PCR檢測HIF-1α對P311mRNA表達水平的影響
與單純?nèi)毖踅M比較,HIF-1抑制劑組細胞缺氧各時相點P311mRNA表達均明顯下降(P值均小于0.05),HIF-1穩(wěn)定劑細胞則在缺氧12和24h明顯升高(P值均小于0.05)。與HIF-1抑制劑組比較,DMSO對照組和HIF-1穩(wěn)定劑細胞在缺氧0、12、24h P311mRNA表達均明顯升高(P值均小于0.05)。與單純?nèi)毖踅M比
16、較,HIF-1抑制劑組細胞缺氧各時相點P311表達均明顯下降(P值均小于0.05),而HIF-1穩(wěn)定劑組則在缺氧12和24h明顯升高(P值均小于0.05)。與HIF-1抑制劑組比較,DMSO對照組和HIF-1穩(wěn)定劑組細胞P311表達缺氧12和24h明顯升高(P值均小于0.05).
3)免疫細胞化學實驗檢測P311表達水平
野生型缺氧對照組、野生型DMSO對照組、野生型HIF-1α抑制劑組、野生型HIF-1α穩(wěn)定劑組各
17、組缺氧12h后P311陽性細胞數(shù)目分別為23.1±1.2、22.5±1.1、6.2±0.8、29.6±1.3;與野生型缺氧對照組相比,野生型抑制劑組12,24h P311表達明顯下降,而野生型HIF-1α穩(wěn)定劑組則明顯上升,P值均<0.05,各組差異有明顯統(tǒng)計學意義.
3.HIF-1α對P311的轉(zhuǎn)錄激活作用
培養(yǎng)0h,空載缺氧組、P311常氧組、P311缺氧組、P311缺氧+HIF-1抑制劑組細胞熒光素酶活性差異無
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