大鼠繼發(fā)性腦室出血損傷機(jī)制及辛伐他汀干預(yù)研究.pdf

1、腦室出血(intraventricular hemorrhage，IVH)是指腦室系統(tǒng)周?chē)蚰X室內(nèi)出血，常繼發(fā)于物理性腦創(chuàng)傷、高血壓腦出血和動(dòng)脈瘤破裂蛛網(wǎng)膜下腔出血等疾病。IVH是腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)患者的最常見(jiàn)同時(shí)也是最嚴(yán)重并發(fā)癥之一，與ICH患者高死亡率和高致殘率密切相關(guān)，嚴(yán)重危害著公眾健康。既往研究報(bào)道，約40％的成人自發(fā)性ICH患者會(huì)合并IVH的出現(xiàn)，這部分病人罹患腦積水的幾率高達(dá)5

2、1％-89％。新近臨床研究已經(jīng)證實(shí)，IVH及其誘發(fā)的繼發(fā)性腦積水是導(dǎo)致ICH患者預(yù)后的兩項(xiàng)獨(dú)立危險(xiǎn)因素，因此，如何緩解IVH后腦積水已經(jīng)逐漸成為ICH救治的重要干預(yù)靶點(diǎn)。
　　然而，既往IVH動(dòng)物模型僅僅展示出了原發(fā)性IVH的特點(diǎn)，而臨床IVH絕大多數(shù)為繼發(fā)性，尤其是繼發(fā)于腦出血破入腦室形成腦室積血。一些回顧性臨床分析提示，繼發(fā)性IVH出現(xiàn)遠(yuǎn)期分流依賴(lài)的腦積水的幾率要明顯高于原發(fā)性IVH，但這一臨床現(xiàn)象尚未得到證實(shí)?；诖?，課題組

3、在國(guó)際上首次建立了繼發(fā)性IVH（腦出血破入腦室）大鼠模型，并對(duì)模型的可靠性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性進(jìn)行了評(píng)價(jià);此外，我們還比較了繼發(fā)性IVH大鼠模型和原發(fā)性IVH大鼠模型腦損傷和腦積水發(fā)生情況，進(jìn)一步驗(yàn)證上述臨床現(xiàn)象。越來(lái)越多的研究證據(jù)指出血液的分解代謝產(chǎn)物-鐵離子可能是導(dǎo)致出血后腦積水和腦損傷的關(guān)鍵因素。據(jù)此我們推測(cè):ICH破入腦室會(huì)引起腦-腦脊液屏障結(jié)構(gòu)完整性破壞，腦實(shí)質(zhì)內(nèi)的血腫可能成為持續(xù)的鐵離子來(lái)源，通過(guò)屏障缺口不斷的浸入到腦室系統(tǒng)，

4、造成腦實(shí)質(zhì)和腦脊液鐵離子蓄積，最終加重腦積水和腦損傷。
　　他汀類(lèi)藥物，即3-羥基-3-甲基戊二酸輔酶A(3-Hydroxy-3-methylglutarylcoenzyme A，HMG-CoA)還原酶抑制劑，是廣泛使用的降脂藥物，臨床上主要用于心腦血管疾病的一級(jí)和二級(jí)預(yù)防。大量研究報(bào)道，他汀類(lèi)藥物除了具有較好的降低膽固醇的功效，還發(fā)揮了保護(hù)BBB、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和促血管再生等多種中樞神經(jīng)保護(hù)多效性。近年來(lái)，幾項(xiàng)大型回顧性隊(duì)列研

5、究結(jié)果顯示:他汀類(lèi)藥物的使用能夠有效地減少I(mǎi)CH患者死亡率，改善遠(yuǎn)期預(yù)后，可能具有良好的臨床應(yīng)用前景。然而，國(guó)際上尚無(wú)權(quán)威的隨機(jī)、對(duì)照臨床試驗(yàn)驗(yàn)證上述功效，尤其是在ICH合并IVH的患者中。辛伐他汀作為一種發(fā)酵來(lái)源的天然他汀類(lèi)藥物，具有高度的親脂性和血腦屏障透過(guò)性。新近研究提示辛伐他汀可能有促進(jìn)血腫吸收的功效。但相關(guān)的機(jī)制不清，辛伐他汀對(duì)繼發(fā)性IVH的潛在治療效果有待進(jìn)一步的觀察。因此，基于上述發(fā)現(xiàn)，我們推測(cè):辛伐他汀有望通過(guò)加速腦內(nèi)血

6、腫清除緩解繼發(fā)性IVH后腦損傷。
　　綜上，本研究主要從以下三部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容進(jìn)行展開(kāi):首先，建立并評(píng)估繼發(fā)性IVH大鼠模型的穩(wěn)定性、可靠性和可重復(fù)性。其次，將原發(fā)性IVH大鼠模型與繼發(fā)性IVH大鼠模型進(jìn)行比較，觀察繼發(fā)性IVH是否會(huì)出現(xiàn)更為嚴(yán)重的腦損傷和腦積水，以驗(yàn)證上述臨床觀點(diǎn);同時(shí)進(jìn)一步探討腦內(nèi)血腫在繼發(fā)性IVH后腦積水發(fā)生發(fā)展中的作用。最后，驗(yàn)證早期系統(tǒng)性辛伐他汀治療能否加速腦內(nèi)血腫清除緩解繼發(fā)性IVH后腦積水，改善神經(jīng)功能障

7、礙。
　　一、大鼠繼發(fā)性腦室出血新模型的建立和評(píng)估
　　目的：
　　自發(fā)性腦出血合并腦室出血是一種嚴(yán)重的臨床疾病，但缺乏相應(yīng)的研究。到目前為止，尚無(wú)滿(mǎn)意、有效的動(dòng)物模型能夠模擬腦出血合并腦室出血的臨床特點(diǎn)。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)擬建立實(shí)驗(yàn)性腦出血合并腦室出血大鼠模型，同時(shí)對(duì)出血后腦積水以及血腫周?chē)M織損傷進(jìn)行檢測(cè)以評(píng)估模型的穩(wěn)定性和可靠性。
　　方法：
　　在課題組前期建立的IVH大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ突A(chǔ)上，通過(guò)調(diào)整血液注

8、射坐標(biāo)，利用立體定位儀將200μL自體血緩慢注入大鼠右側(cè)紋狀體區(qū)（坐標(biāo)為:前囟后0.2mm，旁開(kāi)2.2mm，深5.0mm）。24h后，采用組織形態(tài)學(xué)等方法檢測(cè)血腫及血腫周?chē)M織損傷。損傷后第4周，利用小動(dòng)物MRI觀察腦室擴(kuò)張情況、腦組織丟失情況、海馬體積大小以及大腦皮層厚度;通過(guò)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)認(rèn)知功能。
　　結(jié)果：
　　1.自體血紋狀體注射后，大鼠形成了穩(wěn)定可重復(fù)的腦內(nèi)血腫和腦室擴(kuò)張，較好的模擬了ICH合

9、并破入腦室患者的臨床特點(diǎn);
　　2.模型大鼠在表現(xiàn)出了急性期的腦水腫、BBB破壞和典型的血腫周?chē)X組織損傷的病理特征;
　　3.術(shù)后第4周時(shí)，T2WI掃描觀察到了顯著的腦積水和腦組織丟失，Morris水迷宮測(cè)試揭示了大鼠出現(xiàn)了嚴(yán)重的學(xué)習(xí)、記憶功能障礙。
　　結(jié)論：
　　該模型成功地再現(xiàn)了ICH合并IVH患者的臨床病理生理特點(diǎn)，可用于對(duì)出血后慢性腦積水及血腫周?chē)X組織損傷發(fā)生的病理生理機(jī)制的進(jìn)一步探索。
　　

10、關(guān)鍵詞:動(dòng)物模型;腦出血;腦室出血;慢性腦積水;血腫周?chē)M織損傷
　　二、大鼠繼發(fā)性與原發(fā)性腦室出血模型腦損傷比較及機(jī)制研究
　　目的：
　　有研究報(bào)道稱(chēng)，腦出血合并腦室出血的患者發(fā)生腦積水的幾率較高，會(huì)進(jìn)一步加重腦出血患者的不良預(yù)后。但是，介導(dǎo)上述臨床現(xiàn)象的對(duì)應(yīng)機(jī)制仍然沒(méi)有得到合理的解答。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討繼發(fā)性腦室出血后腦積水發(fā)生發(fā)展機(jī)理，初步闡明上述臨床現(xiàn)象的潛在機(jī)制。
　　方法：

11、　　本部分實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)自體血注射法建立了腦出血合并腦室出血大鼠模型和原發(fā)性腦室出血大鼠模型兩種實(shí)驗(yàn)性腦室出血?jiǎng)游锬Ｐ?。然后，分別采用了小動(dòng)物磁共振掃描成像、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、腦含水量檢測(cè)、伊文思藍(lán)滲出檢測(cè)、免疫組化染色、免疫蛋白印跡、鐵離子定量檢測(cè)和電鏡等技術(shù)和手段對(duì)兩組模型大鼠進(jìn)行了評(píng)價(jià)和比較。最后，通過(guò)給予去鐵敏（一種鐵螯合劑）治療初步闡明鐵離子在繼發(fā)性腦室出血后腦積水發(fā)生中的作用。
　　結(jié)果：
　　1.盡管兩組腦

12、室出血模型接受了同等劑量的腦組織血液注射，與原發(fā)性腦室出血組相比，繼發(fā)性腦室出血大鼠出現(xiàn)了更為嚴(yán)重的腦室擴(kuò)張、室管膜纖毛損傷和鐵超載，以及更加異常的急性腦損傷和神經(jīng)功能障礙;
　　2.系統(tǒng)性去鐵敏治療更加顯著、有效地緩解了繼發(fā)性腦室出血組大鼠所并發(fā)的腦積水。
　　結(jié)論：
　　我們的研究結(jié)果提示，繼發(fā)性的腦室出血比原發(fā)性的腦室出血損傷更嚴(yán)重，主要表現(xiàn)為更加典型的慢性腦積水和腦鐵超載。腦內(nèi)血腫可能通過(guò)加劇鐵離子持續(xù)性的蓄積

13、影響了繼發(fā)性腦室出血后慢性腦積水的進(jìn)展。
　　關(guān)鍵詞:腦損傷;腦出血;腦積水;鐵
　　三、辛伐他汀對(duì)大鼠繼發(fā)性腦室出血后腦損傷的干預(yù)效應(yīng)和機(jī)制研究
　　目的：
　　我們?cè)诘诙糠盅芯恐邪l(fā)現(xiàn)了，腦內(nèi)血腫通過(guò)加劇鐵超載誘發(fā)室管膜纖毛損害，進(jìn)而加重腦室出血腦積水。因此，我們推測(cè):加速腦內(nèi)血腫自吸收可能成為治療腦室出血的研究新靶點(diǎn)。新近文獻(xiàn)提示，辛伐他汀可能具有加速血腫吸收的功效，因此，本實(shí)驗(yàn)擬觀察辛伐他汀對(duì)腦室出血大鼠

14、的治療效果。
　　方法：
　　采用自體血注射法建立腦出血合并腦室出血SD大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。模型?dòng)物在術(shù)后第1d隨機(jī)接受辛伐他汀或溶劑治療，然后連續(xù)給藥1周。利用小動(dòng)物磁共振成像技術(shù)于術(shù)后1天、3天、7天、14天和28天動(dòng)態(tài)觀察并計(jì)算大鼠側(cè)腦室體積。期間，在術(shù)后1-7天和術(shù)后23-28天分別進(jìn)行大鼠運(yùn)動(dòng)功能和神經(jīng)認(rèn)知功能的評(píng)估。然后剝離腦組織樣本，先后進(jìn)行鐵沉積檢測(cè)、鐵相關(guān)蛋白檢測(cè)以及室管膜損傷檢測(cè)等。最后，在腦室出血接受連續(xù)3d

15、的辛伐他汀治療后，采用免疫蛋白印跡和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)清道夫受體CD36（能夠加速細(xì)胞吞噬）在腦組織中的表達(dá)與分布;同時(shí)，采用熒光素標(biāo)記紅細(xì)胞腦內(nèi)注射模擬腦出血，分別給予生理鹽水、辛伐他汀、辛伐他汀+CD36中和抗體治療，3d后采用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)觀察和分析小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)紅細(xì)胞的吞噬情況。
　　結(jié)果：
　　1.辛伐他汀顯著升高了血腫吸收速度，減小了腦室體積，并有效緩解了腦室出血大鼠的神經(jīng)功能障礙;
　　2.與對(duì)照組相比，辛