PKM2促進結腸癌細胞遷移、粘附及炎癥因子分泌的機制研究.pdf

1、結直腸癌（colorectal cancer, CRC）作為消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，全球每年新發(fā)病例超過120萬，并且每年約有60萬人死于CRC。手術切除原發(fā)性腫瘤是治療結直腸癌的首選方式，但手術后因感染誘發(fā)的炎癥反應及腫瘤遠端轉移是導致 CRC患者預后較差的主要原因。腫瘤轉移是一個多因素、多基因參與的過程，包括細胞與細胞間的粘附降低、細胞與細胞外基質的粘附能力增強、基質金屬蛋白酶降解細胞外基質等。其中，細胞遷移和粘附是腫瘤遷移能力的

2、重要指標。脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）作為革蘭氏陰性菌外膜上的一種糖蛋白，可引起全身炎癥反應和嚴重敗血癥，與CRC術后腹內感染并發(fā)癥有關。結直腸癌患者手術后，LPS含量會明顯上升并引起炎癥反應。然而LPS在CRC進程中的明確作用目前仍不清楚。因此，研究CRC粘附、轉移及炎癥微環(huán)境改變誘導CRC惡性轉化的分子機理，對減少CRC患者的發(fā)病率和死亡率具有重要意義。
　　無論氧氣存在與否，腫瘤細胞主要依賴糖酵解

3、而不是氧化磷酸化進行葡萄糖代謝，這一糖代謝異?，F(xiàn)象稱為Warburg效應。目前認為，M2型丙酮酸激酶在Warburg效應中發(fā)揮著重要作用。丙酮酸激酶（Pyruvate kinase, PK）作為糖酵解途徑的限速酶，能夠將磷酸烯醇式丙酮酸轉變成丙酮酸。PKM1和PKM2作為PK最為常見的兩個亞型，由PKM基因經選擇性剪接產生。PKM1蛋白主要在除了肝、腎和血紅細胞之外的正常細胞中高表達，而 PKM2蛋白則在干細胞和腫瘤細胞中高表達。PKM

4、1具有穩(wěn)定的四聚體結構，不受別構調節(jié)。PKM2受到別構調控，并在腫瘤細胞內發(fā)生二聚體和四聚體間轉化。PKM2四聚體具有較高的丙酮酸激酶活性，而二聚體形式則具有蛋白激酶活性，兩種活性的轉換為腫瘤細胞提供生長優(yōu)勢和對微環(huán)境的適應能力。已有報道顯示，PKM2在腫瘤細胞增殖、惡性轉化、血管生成和細胞周期進展中發(fā)揮著重要作用。然而，PKM1和 PKM2在結腸癌細胞粘附、轉移及炎癥微環(huán)境的作用仍不明確。
　　本文通過構建穩(wěn)定敲低PKM的DLD

5、1細胞株以及穩(wěn)定過表達PKM1、PKM2及PKM2不同活性突變體的DLD1細胞株，分別探討了PKM1與PKM2在結腸癌細胞遷移與粘附、炎癥因子分泌與增殖調控中的作用與機制；通過原核表達GST-PKM1、GST-PKM2融合蛋白來模擬分泌型PKM1和PKM2，檢測其對結腸癌細胞遷移能力的影響并探討其作用機制。獲得以下研究結果：
　　1.通過構建敲低PKM、過表達PKM1、PKM2以及過表達PKM2的K367M、R399E和K433E

6、等突變體的慢病毒表達載體。采用慢病毒包裝、收獲、轉染結腸癌DLD1細胞，經puromycin篩選、qPCR和western blot技術檢測，得到穩(wěn)定細胞株。
　　2.通過細胞劃痕法和細胞基質粘附實驗，我們發(fā)現(xiàn)過表達PKM2，而不是PKM1，能夠明顯促進結腸癌細胞遷移及粘附。qPCR和western blot結果顯示，過表達PKM2能明顯提高N-cadherin、MMP-2、MMP-9、Snail-2的表達，促進FAK的磷酸化以及

7、β1-integrin的活化，并抑制E-cadherin的表達。敲低PKM能明顯逆轉PKM2誘導的遷移粘附相關信號分子的表達。特別是過表達PKM2能夠上調STAT3的mRNA水平、蛋白水平、磷酸化水平以及STAT3的核轉位。放線菌素D實驗顯示，PKM2上調STAT3的表達主要是通過調控其轉錄水平，而不是通過抑制mRNA降解。在過表達PKM2的細胞株中瞬時敲低 STAT3的表達，結果表明，敲低 STAT3能夠有效逆轉 PKM2誘導的遷移粘

8、附相關信號分子的表達及細胞遷移。通過檢測 PKM2不同活性點突變的穩(wěn)定細胞株中丙酮酸激酶活性、STAT3的表達和磷酸化水平以及細胞遷移能力，發(fā)現(xiàn) DLD1-R399E細胞缺乏丙酮酸激酶活性，能明顯增加 STAT3和磷酸化 STAT3的表達，促進結腸癌細胞遷移。
　　3. LPS可以明顯促進DLD1細胞中PKM2、TNF-α、IL-1β的表達，并具有濃度依賴性，而PKM1的表達不受LPS影響。同時發(fā)現(xiàn)LPS可以促進DLD1細胞增殖。

9、Western blot、qPCR、ELISA以及MTT結果顯示，敲低PKM能夠抑制LPS誘導的TNF-α、IL-1β的表達、分泌以及結腸癌細胞增殖。過表達PKM2可以明顯促進TNF-α、IL-1β的表達以及LPS誘導的結腸癌細胞增殖。NF-κB的抑制劑BAY-11-7082能夠明顯抑制LPS誘導的NF-κB亞基p65、PKM2的表達。敲低PKM能顯著抑制LPS誘導的STAT3的表達和核轉位，而對LPS誘導的p65的表達和核轉位無影響。

10、在過表達PKM2細胞中瞬時敲低STAT3，可以逆轉由PKM2引起的TNF-α和IL-1β的表達。染色質免疫共沉淀結果顯示，LPS能促進PKM2與STAT3啟動子的結合，通過促進STAT3的轉錄來調控 TNF-α、IL-1β的表達。DLD1-R399E細胞能明顯促進 STAT3的表達和TNF-α、IL-1β的分泌。
　　4.通過原核表達純化 GST-PKM1、GST-PKM2處理 DLD1細胞模擬分泌型PKM1、PKM2的功能，發(fā)現(xiàn)

11、分泌型PKM2能促進結腸癌細胞遷移。敲低PKM2能明顯減少PKM2的分泌及由分泌型PKM2誘導的結腸癌細胞遷移。分泌型PKM2能促進 MMP-2、MMP-9、N-cadherin、β-catenin的表達，抑制 E-cadherin的表達。分泌型PKM2能夠促進Akt的磷酸化，而PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002能抑制分泌型PKM2誘導的結腸癌細胞遷移及E-cadherin、N-cadherin和β-catenin的表達。采

12、用 siRNA干擾β-catenin表達，可以明顯逆轉分泌型 PKM2誘導的 E-cadherin、N-cadherin的表達。
　　綜上所述：PKM2依賴其蛋白激酶活性而不是丙酮酸激酶活性，調控STAT3轉錄，促進結腸癌細胞遷移和粘附。LPS通過誘導PKM2表達、增強PKM2與STAT3基因啟動子結合、加強STAT3的表達與核轉位，調控結腸癌細胞TNF-α和IL-1β的表達與分泌。分泌型PKM2能通過PI3K/Akt和β-cat