有機磷降解酶基因(opdA)在大腸桿菌與枯草芽孢桿菌中的表達與酶學研究.pdf

1、有機磷農藥(organophosphates, OPs)具有殺蟲效率高、防治范圍廣、成本低等特點,在保護農作物免受病蟲害侵染、提高糧食產量等方面發(fā)揮了巨大作用。但它們對人類的生存環(huán)境造成了嚴重的污染,并導致瓜果與蔬菜等農產品農藥殘留超標,直接危害人類與動物的健康。所以有機磷農藥降解方面的研究在環(huán)境保護和食品安全方面受到了高度關注。
　　研究發(fā)現(xiàn),一些能降解有機磷農藥的降解菌的降解作用是通過產生有機磷降解酶來實現(xiàn)的。而直接使用此類有

2、機磷降解酶降解有機磷農藥的效率遠高于使用產生此類酶的降解菌。
　　來源于土壤桿菌屬Agrobacterium radiobacter P230的有機磷降解酶(OpdA)具有底物范圍廣和催化效率高的特點,因此被公認為是迄今為止最具有應用前景的有機磷降解酶。有機磷降解酶通過水解有機磷農藥的磷脂鍵,最終實現(xiàn)有機磷農藥的無毒化。本研究旨在利用已有的研究基礎,建立有機磷降解酶基因(opdA)大腸桿菌表達系統(tǒng),實現(xiàn)其高效表達;同時對枯草芽孢桿

3、菌的電轉化條件進行優(yōu)化,建立高效的電轉化方法,并構建有機磷降解酶基因(opdA)在枯草芽孢桿菌中的分泌表達系統(tǒng),克服重組蛋白在大腸桿菌表達系統(tǒng)以包涵體的形式在胞質中形成造成重組蛋白復性困難這一難題。
　　1.有機磷降解酶基因(opdA)在大腸桿菌中的高效表達與酶學研究
　　使用限制性內切酶Xho I和BamHI雙酶切目的片段與表達質粒,將擴增的opdA基因定向插入到原核表達載體pET-28b中,構建大腸桿菌表達載體pET-2

4、8b-opdA,并將其轉化到E. coli BL21(DE3)中獲得重組工程菌株,經IPTG誘導實現(xiàn)高效表達,并對重組菌株的誘導表達條件進行優(yōu)化,實驗結果是:誘導前菌液OD600的吸光值為0.5時,經1.25 mmol/L IPTG在37℃下誘導表達5h,重組蛋白表達量最大。重組蛋白OpdA對甲基對硫磷的Km值為42.6μmol/L,其Vmax為32.669μmol/L·min。比酶活為24.48U/mg。
　　2.枯草芽孢桿菌電

5、轉化條件的優(yōu)化研究
　　將穿梭質粒pHY300PLK電轉化至枯草芽孢桿菌,對電轉化條件GM培養(yǎng)基、EM培養(yǎng)基、RM培養(yǎng)基、電擊時電場強度、質粒濃度進行優(yōu)化。實驗結果是:在GM-2培養(yǎng)基(LB+0.5 M sorbitol)、EM-6培養(yǎng)基(0.5 M sorbitol+0.5 M mannitol+10％Glycero)、RM-6(LB+0.5 M sorbitol+0.38 M mannitol)、電擊電壓為2.0KV、質粒濃度

6、為100 ng/μl條件下,電轉化率最高,枯草芽孢桿菌電轉化率為1.45x103個/μg DNA。
　　3.有機磷降解酶基因(opdA)在枯草芽孢桿菌中的高效分泌表達與酶學研究
　　利用人工合成方法的獲得opdA基因,構建表達載體pHT43-opdA,并將其轉化至枯草芽孢桿菌WB800N中獲得重組工程菌株。實驗結果是:誘導前菌液OD600的吸光值達到0.7時,經1.25 mmol/L的IPTG在37℃下誘導27h,實現(xiàn)高效分