心肌內(nèi)向整流鉀通道激動劑抑制異丙腎上腺素所致大鼠心室重構(gòu).pdf

1、目的：
　　1.建立大鼠在體和離體心室重構(gòu)模型，檢驗鹽酸扎考必利(zacopride,Zac)對重構(gòu)模型的影響；
　　2.探討zacopride抑制異丙腎上腺素（isoproterenol,Iso）所致大鼠心室重構(gòu)的可能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制；
　　3.應(yīng)用低濃度Ba2+和氯喹（chloroquine，Chlo）(兩者均為IK1相對特異性阻斷劑)對IK1的抑制作用，證實特異性增強IK1與抗心室重構(gòu)效應(yīng)的關(guān)系。
　　方法：<

2、br>　　第一部分:成年大鼠在體實驗
　　SD大鼠稱重，隨機分組：正常對照組、單純zacopride組、Iso模型組、zacopride干預(yù)組、zacopride+氯喹干預(yù)組和卡托普利陽性對照組。除正常對照和單純zacopride組外，其余各組動物均腹腔注射異丙腎上腺素（3 mg/kg/d），正常對照組腹腔注射等量的生理鹽水，zacopride干預(yù)組腹腔注射15μg/kg，zacopride+氯喹組同時腹腔注射15μg/kgzac

3、opride和7.5μg/kg氯喹，卡托普利陽性對照組按100 mg/kg/d飲水給與卡托普利。連續(xù)10天。所有大鼠均飼以常規(guī)固體飼料和自來水，于停藥24 h禁食過夜，然后觀察相應(yīng)指標。
　　觀測各組全心質(zhì)量與體質(zhì)量(HW/BW，mg/g)比，左心室質(zhì)量與體質(zhì)量(LVW/BW，mg/g)比。用全細胞膜片鉗技術(shù)檢測大鼠心室肌細胞電壓門控鈣電流（ICa-L）、靜息膜電位（RMP）及動作電位（AP）的變化。用Masson’s染色法檢測左

4、室心肌組織的纖維化水平，western blotting測定構(gòu)成IK1的主要亞單位Kir2.1、磷酸化鈣調(diào)蛋白激酶II（p-CaMKII）、肌漿網(wǎng)Ca-ATP酶（SERCA2）和活化凋亡蛋白酶cleaved caspase-3的表達。
　　第二部分:大鼠乳鼠心肌細胞體外實驗
　　新生1～3d SD乳鼠用0.08％胰蛋白酶和0.04%II型膠原酶分離心肌細胞，經(jīng)差速貼壁法和5-溴脫氧尿苷（5-Brdu）純化后隨機分為正常對照組

5、、單純zacopride組、Iso模型組、zacopride干預(yù)組、zacopride+BaCl2干預(yù)組和zacopride+氯喹干預(yù)組，培養(yǎng)24h后用激光共聚焦顯微鏡檢測心肌細胞面積及胞內(nèi)游離鈣離子濃度，流式細胞術(shù)測心肌細胞凋亡。
　　結(jié)果：
　　第一部分成年大鼠在體實驗
　　1.異丙腎上腺素可導(dǎo)致心臟體積增大，全心肥厚指數(shù)、左心室肥厚指數(shù)顯著升高，心臟HE和Masson’s染色顯示心肌纖維增粗，排列紊亂，基質(zhì)膠原沉

6、積，纖維化。而zacopride可有效逆轉(zhuǎn)異丙腎上腺素所致心室重構(gòu)，其效應(yīng)與公認的抗重構(gòu)藥物卡托普利相似。應(yīng)用低劑量氯喹選擇性阻斷IK1可消除zacopride的抗心室重構(gòu)作用；
　　2.長期應(yīng)用異丙腎上腺素可導(dǎo)致心室肌細胞發(fā)生電重構(gòu)，RMP減小，細胞膜去極化，動作電位時程（APD）明顯延長。應(yīng)用zacopride干預(yù)后可使RMP減小或恢復(fù)至生理水平，并縮短APD（P<0.01）。小劑量氯喹選擇性阻斷IK1可消除zacopride

7、的作用（P<0.01）；
　　3.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長期應(yīng)用zacopride對正常大鼠心肌ICa-L無明顯影響；
　　4.Western blotting實驗結(jié)果表明：異丙腎上腺素可導(dǎo)致大鼠心室肌Kir2.1蛋白下調(diào)；細胞內(nèi)鈣依賴性調(diào)節(jié)蛋白比例失衡，磷酸化CaMKII活性增強，SERCA2被抑制，活化的caspase3表達增強。經(jīng)zacopride干預(yù)，大鼠心肌Kir2.1表達增加，CaMKII磷酸化抑制而SERCA2表達增強，鈣

8、穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)蛋白恢復(fù)平衡；并抑制Caspase3的活化。小劑量氯喹選擇性阻斷IK1可消除zacopride的作用。
　　第二部分大鼠乳鼠心肌細胞體外實驗
　　1.在鏡下可見異丙腎上腺素模型組的心肌細胞表面積明顯增大（P<0.01），zacopride干預(yù)后細胞形態(tài)恢復(fù)至正常或接近正常水平（P<0.01）。這一結(jié)果與zacopride逆轉(zhuǎn)在體異丙腎上腺素所致的心肌肥大的作用相一致；
　　2.利用激光共聚焦測定胞內(nèi)鈣濃度，結(jié)果

9、表明zacopride使肥厚模型組心肌細胞內(nèi)升高了的Ca2+濃度顯著降低（P<0.01），而低濃度BaCl2和氯喹作為IK1阻斷劑可逆轉(zhuǎn)zacopride的抗重構(gòu)作用（P<0.05）；
　　3.流式細胞術(shù)結(jié)果表明，zacopride可通過激動IK抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。
　　結(jié)論：
　　1.IK1通道選擇性激動劑zacopride明顯抑制異丙腎上腺素所致的心室重構(gòu)。
　　2.Zacopride通過激動