以AHBA合酶基因為靶標從放線菌中PCR篩選與其相關(guān)化合物產(chǎn)生菌的可行性研究.pdf

1、在微生物體內(nèi)，安莎類化合物的合成起始于3-氨基-5-羥基苯甲酸(AHBA)，然后在I型聚酮合酶的作用下，以乙酸鹽和丙酸鹽為單位進行脂肪鏈的延長，最后經(jīng)環(huán)化、修飾形成不同的安莎類化合物。 AHBA的生物合成途徑與莽草酸生物合成途徑相似，但又有所不同。其不同點在于在AHBA合成過程中有一個氨基的引入，最近的研究認為，AHBA合酶負責氨基引入，它是一種雙功能酶，同時具有氨基轉(zhuǎn)移酶活性和AHBA合酶(脫水和脫氧)的活性。因此AHBA合酶

2、是AHBA生物合成途徑中所特有的一個不可或缺的酶，也是整個安莎類化合物生物合成系統(tǒng)中的一個標志性的酶。迄今為止，除了安莎類化合物以外已知絲裂霉素C的生物合成也起源于AHBA。本課題主要探討了以AHBA合酶基因和其它相關(guān)基因為靶標，通過PCR手段從放線菌中篩選AHBA陽性菌株，從中獲得安莎類或與AHBA合成相關(guān)化合物產(chǎn)生菌的可行性。 首先根據(jù)AHBA合酶的兩個保守區(qū)設(shè)計了一對簡并引物(755a和755b)，初步驗證利用此引物只能在

3、已知安莎類化合物產(chǎn)生菌中特異性地擴增755bp左右的DNA片段。然后利用該引物對2000株放線菌中的基因組DNA進行了高通量PCR篩選，經(jīng)測序驗證，最終獲得了33株含有AHBA合酶基因的陽性菌株。進而我們根據(jù)安莎類化合物生物合成基因簇中AHBA合酶基因、氧化還原酶基因、磷酸化酶基因連鎖(AOP基因連鎖)的特點，分別設(shè)計了另外四條簡并性引物，并對33株陽性菌進行了復(fù)篩。結(jié)果表明：其中的27株陽性菌株都有AOP基因連鎖的特點，從而進一步說明

4、這些菌株可能具備合成安莎類化合物的潛力。 為進一步研究這些AHBA陽性菌株的背景、來源和特性，我們對33株陽性菌進行了初步的分類鑒定以及發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化和產(chǎn)物生物活性的測定(包括抗菌、抗腫瘤以及抗病毒)，從而為下一步的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定工作奠定了基礎(chǔ)。將所獲得的33個基因與功能已知的AHBA合酶基因進行了多序列比對和進化樹分析。結(jié)果表明進化樹大致形成了三個明顯的分支，即萘安莎類和苯安莎類AHBA合酶基因分別位于兩個不同的分支，而

5、用于非安莎類生物合成的AHBA合酶基因則處于一個單獨的分支。而且參與形成相似結(jié)構(gòu)化合物的AHBA合酶基因在進化樹中也比較相近。因此AHBA合酶基因序列中的進化信息有可能用于分析預(yù)測AHBA來源的化合物的結(jié)構(gòu)。 為了驗證上述設(shè)想，我們選定了六株AHBA陽性菌株(編號分別為4-4、3-57、22-24、22-187、192、4353)，對其發(fā)酵產(chǎn)物進行了分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定。從菌株4-4和3-57中檢測到了格爾德霉素(苯安莎類)，從菌

6、株192和22-187中檢測到了利福霉素B和利福霉素SV；至于菌株22-24，我們目前只分離得到了尼日利亞菌素(非安莎類)，但是已有文獻報道：該類型的菌株除了產(chǎn)尼日利亞菌素外還產(chǎn)生少量的除草霉素(與格爾德霉素結(jié)構(gòu)類似的安莎類化合物)，因此該菌株中的AHBA合酶基因可能用于除草霉素的生物合成。 本研究初步證明利用PCR AHBA合成基因從放線菌篩選與之相關(guān)化合物產(chǎn)生菌的可行性，同時也驗證了AHBA合酶基因的序列分析在推測相應(yīng)安莎類

7、化合物結(jié)構(gòu)方面的作用；從而為尋找新的安莎類以及AHBA相關(guān)化合物產(chǎn)生菌開辟了一條新的途徑。 利用單基因交換阻斷技術(shù)研究了4353和4088的AHBA合酶基因與產(chǎn)物的相關(guān)性，結(jié)果表明，4353變株喪失了產(chǎn)生放線菌素D的能力，而4088變株產(chǎn)生了原株中未見到的抗菌活性代謝產(chǎn)物，這些結(jié)果一方面提示，基因阻斷技術(shù)尚需改進，另一方面也說明AHBA合成機制及微生物代謝的復(fù)雜性，需要我們付出更多的努力，才能完善利用基因探針篩選與AHBA相關(guān)代