表面等離子技術(shù)結(jié)合滾環(huán)擴增法檢測丙型肝炎病毒.pdf

1、研究背景和目的:
　　 目前常規(guī)檢測丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)的方法主要包括核心抗原檢測、抗體檢測以及核酸檢測。多年以來，很多研究試圖建立血液中各種HCV抗原抗體以及核酸的檢測方法，但由于人體血液中HCV抗原抗體及核酸含量過低，用這些常規(guī)方法有時會無法檢測出HCV。
　　 HCV核心抗原檢測方法主要是用雙抗體夾心法檢測人體血清中的丙型肝炎核心抗原，該方法的基本步驟是:用基因工程制備核心抗原

2、進行小鼠免疫后獲得純抗HCV核心抗原的單抗作為固相包被物，配合使用辣根過氧化物酶標記物的2抗，與血清中的HCV核心抗原反應，顯色后進行定性或定量測定。該方法檢測具有延后性，而且靈敏度不高。
　　 另外一種檢測HCV的方法是將HCV病毒經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再通過PCR將cDNA擴增進行檢測。但是由于血液中的 RNA濃度低，有時并不能檢測到HCV的 RNA，所以傳統(tǒng)的方法不能滿足丙肝病人的血清或者分泌物中極低濃度的RNA檢測。

3、r>　　 近年來，表面等離子共振(surface plasmon resonance，SPR)已逐步成為研究和識別生物活性材料親和力作用的主要方法之一。SPR傳感器已逐步應用到分析抗原抗體反應、觀察DNA的雜交、診斷細菌和病毒引起的疾病和觀察血液凝固等。SPR傳感器之所以能夠?qū)⒕哂邢嗨苹瘜W結(jié)構(gòu)的混合物區(qū)分開，是因為SPR能夠識別這些分析物，并且這些分析物能夠和固定在SPR傳感器表面上的生物活性物質(zhì)發(fā)生特異性反應。SPR傳感器還可以免標

4、記、實時監(jiān)測分析物和活性物質(zhì)之間發(fā)生的反應。SPR傳感器不僅可以監(jiān)測固定在材料上的分析物，還可以分析經(jīng)過解離新形成的混合物，在很多情況下，SPR可以用同一個芯片，進行同時測量。因此，目前SPR是觀察配體和受體之間、抗原和抗體之間相互作用最有前景的一個方法，并且逐步應用到生物醫(yī)學當中。SPR在不斷擴展其應用領(lǐng)域時，其檢測方法的靈敏度也需要不斷得到提高。因為SPR方法對待測物濃度的測定主要與物質(zhì)的分子量有關(guān)，對于分子量大于1000的物質(zhì)，其

5、可測定濃度范圍約為nM-pM，而對于分子量小于1000的物質(zhì)，其可測定濃度范圍為μM-nM。因此不斷探索提高靈敏度的研究方法正成為SPR研究中的一個重要內(nèi)容。
　　 DNA芯片被大量用于快速、平行檢測多種DNA或RNA序列。隨著越來越多的斑點技術(shù)的擴展，現(xiàn)在使用噴墨打印或光刻生產(chǎn)的DNA芯片，可以在一個小面積的固體支持物上點上15000種寡核苷酸鏈，因此目前很多研究已將DNA芯片應用到mRNA定性定量檢測和單核苷酸多態(tài)性(sin

6、gle nucleotide polymorphisms，SNPs)的檢測。隨著DNA芯片技術(shù)的發(fā)展使得單個DNA芯片探測整個基因組成為可能，但對低濃度的DNA靶序列檢測存在靈敏度不高的問題依然是當前芯片的主要缺點。而液相預擴增方法可克服這一缺點，例如聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)，可用來擴增芯片分析的目標DNA。PCR技術(shù)由于其高靈敏度而被認為是DNA檢測的金標準。但是，PCR技術(shù)因為

7、需要昂貴的儀器、精確的溫度控制和對其產(chǎn)物進行凝膠電泳分離，況且不能原位擴增，使它在芯片上的運用受到極大地限制。因而迫切需要一種高靈敏度、高通量和高速度非PCR的簡單的檢測分析方法。
　　 滾環(huán)擴增(rolling circle amplification，RCA)在體外使用DNA聚合酶和環(huán)狀DNA模板進行信號擴增，其基本原理是:環(huán)狀模板與靶核酸雜交后在連接酶的作用下成環(huán);成環(huán)后的環(huán)狀模板在引物的作用下擴增;沿著環(huán)狀模板擴增一個循

8、環(huán)后，聚合酶合成再次到達了引物聚合酶結(jié)合位點取代新合成的DNA鏈;繼續(xù)合成多個環(huán)狀模板長度的擴增鏈，由此形成一條由重復的環(huán)狀模板序列組成的長鏈DNA分子。并且由于環(huán)狀模板的擴增效率比線性模板要高很多，因此單引物RCA已被廣泛用于基因分型和掛鎖探針進行突變分析。
　　 RCA是一種對芯片信號放大特別有效的方法，在芯片上就能夠識別、擴增、檢測目標分子。與其它擴增方法相區(qū)別的是，RCA擴增生成的擴增產(chǎn)物仍然和固定在芯片上的DNA引物連

9、接。由于這種獨特的屬性，使RCA能在固相的原位產(chǎn)生微陣列信號，并且與其它反應同時進行也沒有任何互相干擾。
　　 基于納米金的光學檢測可以提供一個可視化的可見光范圍。由于這種光學檢測是依靠基礎(chǔ)的光學現(xiàn)象，所以檢測過程比熒光技術(shù)要簡單得多，樣品的穩(wěn)定性也被加強了。相比于熒光染料具有敏感性和漂白問題，納米金技術(shù)即使是在高光強度下也可進行檢測，并且還能降低理化環(huán)境對信號的影響。
　　 納米金技術(shù)可以擴增SPR的檢測信號，相比非納

10、米金輔助的雜交反應大大提高了靈敏度。表面質(zhì)量高和介電常數(shù)高的納米金粒子和金膜之間的電磁耦合大大提高了反射轉(zhuǎn)變。納米金粒子標簽具有高信號/噪聲比使得點大小接近亞微米級，而熒光芯片僅有微米級。納米金法可以利用光學方法讀出結(jié)果而不需要熒光設(shè)備，并且納米金修飾的寡核苷酸探針可以再生方法再利用，以節(jié)約成本。
　　 本文將生物傳感技術(shù)、原位擴增技術(shù)以及納米技術(shù)相結(jié)合，運用SPR儀檢測納米金輔助的RCA反應，實現(xiàn)快速、非標記、靈敏、實時檢測丙

11、型肝炎病毒。
　　 研究方法:
　　 1.丙型肝炎病毒RCA檢測方法的建立
　　 1.1.RCA引物設(shè)計
　　 從GeneBank中獲得丙型肝炎病毒X-tail基因序列，根據(jù)RCA引物設(shè)計的原則，設(shè)計RCA檢測HCV所需要的環(huán)狀模板、延伸引物以及擴增引物。
　　 1.2.丙型肝炎病毒核酸RCA檢測方法反應條件摸索以及反應體系的建立
　　 根據(jù)反應體系進行優(yōu)化，將連接酶分為T4 DNA連接酶

12、、pfuDNA連接酶和BSTDNA連接酶三組。將多聚酶分為BSTDNA多聚酶和phi29DNA連接酶兩組，共六組進行試驗。依據(jù)Tm值，RCA反應原理以及酶的活性溫度，來測試反應溫度。
　　 1.3.丙型肝炎病毒核酸RCA檢測方法特異性測試
　　 選取流感病毒核酸作為陰性對照，選取實驗室制備的丙型肝炎病毒核酸純化標準品作為陽性對照，雙蒸水作為空白對照，以RCA方法評價丙型肝炎病毒的特異性。
　　 1.4.丙型肝炎病

13、毒RCA檢測方法最低檢測濃度測試
　　 將經(jīng)過定量的HCV cDNA陽性標準品，進行10倍梯度稀釋，運用RCA方法確定其檢測限值。
　　 2.Real-time RT-PCR法檢測丙型肝炎病毒
　　 選取HCV最保守區(qū)域X-tail基因區(qū)域為目的序列，設(shè)計Real-time PCR引物。運用Real-time PCR法檢測HCV，通過檢測梯度濃度確定其檢測限，與RCA的檢測限進行比較。
　　 3.滾環(huán)擴增

14、芯片檢測HCV cDNA
　　 將RCA的探針進行氨基修飾，與醛基芯片共價結(jié)合后，通入檢測體系進行滾環(huán)擴增反應，最后進行顯色反應，以檢測HCV DNA。
　　 4.傳統(tǒng)芯片檢測HCV cDNA
　　 將經(jīng)過定量的HCV cDNA陽性標準品，進行10倍梯度稀釋，用傳統(tǒng)芯片檢測，并將其檢測限值與RCA芯片法進行比較。
　　 5.SPR技術(shù)結(jié)合RCA法檢測HCV
　　 根據(jù)丙型肝炎X-tail區(qū)域的特異

15、序列，設(shè)計并合成RCA法的探針和引物，同時設(shè)立陰性對照。將模板濃度10倍梯度稀釋，評價方法的檢測限。在普通金膜芯片的基礎(chǔ)上，經(jīng)過表面化學處理，形成高特異性核酸芯片，用抗蛋白實驗驗證芯片抗蛋白能力。使用SPR儀對金膜芯片上滾環(huán)擴增的反應進行動態(tài)觀測以及信號放大反應等。
　　 6.普通SPR技術(shù)對HCV的檢測
　　 (1)普通SPR金膜芯片制備:將裸金膜芯片孵育于12巰基十二烷酸中過夜進行自組裝羧基化，再用EDC/NHC(1

16、-乙基-3(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC); N-羥基丁二酰亞胺(N-hydroxysuceini- mide，NHS))進行活化后點樣探針。
　　 (2)用1％的BSA對未結(jié)合位點進行封閉。
　　 (3)評價SPR檢測HCV的靈敏度、特異性。
　　 7.運用RCA、，real-time PCR、genochip、，RCA genochip、SPR、SPR結(jié)合RCA等技術(shù)對臨床樣品HCV的檢測。
　　

17、 采用1～6方法中描述的丙型肝炎病毒RCA、Real-Time RT-PCR、滾環(huán)擴增芯片法、傳統(tǒng)芯片方法、SPR技術(shù)結(jié)合RCA法、普通SPR法檢測臨床血清標本中的丙型肝炎病毒。對上述檢測方法的靈敏度，特異性以及一些其它指標進行評價。
　　 結(jié)果:
　　 1.丙型肝炎病毒RCA方法的實驗室評價以及評價臨床樣品的檢測
　　 RCA方法對HCV的最低檢測濃度為10pM，Real-time RT-PCR檢測的的最低濃

18、度為0.1nM。
　　 對63份標本進行檢測，其中丙型肝炎病人血清標本30份，非丙型肝炎血清標本33份。在雙盲的情況下，RCA法的靈敏度為80.0％(24/30)，檢測30份丙型肝炎血清標本，實時熒光定量PCR檢出16份。RCA檢測33份HCV陰性血清特異度為87.9％(29/33)，實時熒光定量PCR為90.9％(30/33)。
　　 2.建立滾環(huán)擴增芯片檢測HCV的方法以及對臨床樣品檢測的評價
　　 RCA芯

19、片法檢測HCV的最低檢測濃度為0.1μM。而應用傳統(tǒng)雜交方法檢測HCV cDNA陽性標準品的最低濃度為10μM。說明在實驗室條件下檢測HCVeDNA，RCA比傳統(tǒng)雜交法更敏感。
　　 用RCA芯片對一共179份臨床血清進行了檢測，其中包括丙型肝炎病人血清樣品102份，甲肝及乙肝病人的血清樣品77份。在雙盲的情況下，RCA的敏感性為87.3％(89/102)，特異性為85.7％(66/77)，一致性為86.6％(155/179)，

20、結(jié)果顯示RCA芯片法檢測HCV的靈敏度和特異度均較好。陽性預測值為89％(89/100)，陰性預測值為83.5％(66/79)。檢測102份丙型肝炎血清標本，RCA芯片檢測出89份，普通芯片只檢出27份。檢測77份陰性樣品，RCA檢測為陰性的66份，普通芯片為69份。RCA芯片高靈敏度、快速，因此在丙型肝炎病毒的檢測中比現(xiàn)有的普通芯片有更大的優(yōu)越性和實用性。
　　 3.SPR技術(shù)結(jié)合滾環(huán)擴增技術(shù)檢測臨床樣品中HCV
　　

21、 滾環(huán)擴增法在1h內(nèi)完成HCV標準品的檢測，SPR結(jié)合RCA方法對HCV的陽性標準品的最低檢測濃度為1pmol/L，Real-time PCR的最低檢測濃度為100pmol/L。在檢測相同的HCV濃度時，RCA的SPR信號明顯高于傳統(tǒng)的雜交信號，RCA反應經(jīng)過納米金信號放大，整個反應過程更加清晰，反應信號也得到擴大。對于臨床樣品的檢測，RCA結(jié)合SPR技術(shù)的靈敏度為90％(27/30)，特異性為84.1％(28/33)。
　　

22、結(jié)論:
　　 1.本研究建立的SPR結(jié)合RCA方法，在1h內(nèi)完成HCV的檢測，比熒光定量PCR有更低的檢測限。
　　 2.運用RCA法檢測同樣濃度的HCV時，RCA的SPR信號明顯高于傳統(tǒng)的雜交的SPR信號RCA，經(jīng)過納米金的信號放大，整個反應過程流程更加清晰，反應信號得到進一步擴大。
　　 3.對于臨床血清樣品，研究結(jié)果顯示RCA法的靈敏度比real-timePCR要高，特異度沒有統(tǒng)計學差別。
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