轉錄調控因子E2F對Op18基因表達及腫瘤細胞生物學行為作用研究.pdf

1、Op18是一種重要的細胞信號轉導分子，該蛋白在細胞分化、組織再生、修復及發(fā)育中，尤其是在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及決定表型上具有重要作用及意義，該基因及其表達產(chǎn)物是一個極具吸引力的惡性腫瘤生物治療新靶點。 但是，op18在腫瘤組織中過表達的調控機制尚未闡明。核轉錄因子E2F對細胞周期的調控至關重要，研究顯示，op18基因啟動子上存在E2F的結合位點，說明op18是轉錄因子E2F調控的靶基因。本實驗旨在探討轉錄因子E2F對op18基因

2、的調控機制及對腫瘤細胞生物學行為的效應機制，從而為腫瘤的生物治療尋找新的技術方法。 目的：設計合成轉錄因子E2F啞鈴形圈套寡核苷酸（Decoy ODNs圈套寡核苷酸）并構建腫瘤特異性survivin啟動子調控的E2F1 siRNA逆轉錄病毒載體，探討轉錄因子E2F對腫瘤細胞而非正常細胞中op18基因調控機理及對腫瘤細胞增殖的影響。 方法： (1)將體外設計合成的啞鈴形圈套寡核苷酸在陽離子脂質體Lipofectam

3、ineTM2000介導下轉染腫瘤細胞（MKN-45細胞和A549細胞），用RT-PCR檢測轉染細胞中op18 mRNA表達水平，通過MTT實驗觀察轉染細胞的生長抑制情況，TUNEL法觀察轉染細胞凋亡情況。 (2)利用重組DNA技術，將survivin啟動子和E2F1 siRNA基因序列亞克隆至逆轉錄病毒載體pLXSN中，重組質粒pLXSN/Surp/E1在脂質體介導下轉染PA317包裝細胞，G418篩選，直至出現(xiàn)抗性克隆，擴大培

4、養(yǎng)，用NIH3T3測定病毒滴度，將重組病毒感染人肺癌細胞A549，G418篩選出抗性克隆，命名為A549/E1，利用PCR對A549/E1細胞進行鑒定重組逆轉錄病毒是否整合到A549/E1細胞基因組中。 (3)用RT-PCR及Western blot法鑒定A549/E1細胞中op18表達。 (4)測定細胞增殖曲線觀察細胞增殖情況，流式細胞儀技術(FCM)分析轉導后細胞凋亡情況。 結果： (1)啞鈴形圈套寡

5、核苷酸被成功轉染入腫瘤細胞（MKN-45細胞和A549細胞），RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)啞鈴形圈套寡核苷酸處理后的腫瘤細胞中op18mRNA表達水平明顯低于對照組，MTT實驗顯示轉染細胞增殖速度下降而空白對照組無明顯變化，TUNEL凋亡染色可見凋亡細胞。 (2)測序、限制性酶切分析及PCR方法鑒定顯示，成功構建腫瘤特異性survivin啟動子調控的E2F1siRNA的逆轉錄病毒表達載體；獲得高滴度產(chǎn)毒細胞株C28，滴度為2.0×106

6、/ml，重組病毒感染的A549細胞PCR分析證明目的基因已整合至A549/E1細胞基因組中；RT-PCR 、Western blot法鑒定A549/E1細胞中op18表達明顯下調；A549/E1細胞與A549/0細胞、未感染的A549細胞比較，A549/E1生長速度顯著被抑制；流式細胞儀技術(FCM)分析顯示A549/E1細胞調亡明顯增加。 結論：啞鈴形圈套寡核苷酸能特異性抑制E2F轉錄因子對op18基因的轉錄調控，進而抑制op