鈦基種植體表面仿細胞外基質活性涂層的設計、構建及其生物學評價.pdf

1、縮短種植體骨整合時間，達到種植體即刻負載或早期負載是種植體表面改性研究的主要目標。本研究從仿生的視角，采用層層自組裝的方法(LbL technique)，在純鈦片表面以設計、構建仿細胞外基質活性涂層為目標，進行了方法學探討。在此基礎上，對各種涂層進行了詳細的生物學評價。
　　 首先，純鈦片表面經打磨拋光及氧化性混酸溶液處理，得到我們需要的基底面。研究表明這是一個富含羥基且具有良好生物活性的基底面，由于羥基與富含氨基的聚電解質生物

2、大分子之間的氫鍵作用，為我們后續(xù)的組裝提供了可能。接著選擇了4種具有良好骨誘導性的生物大分子（Ⅰ型膠原、殼聚糖、透明質酸和多聚谷氨酸），根據它們等電點的不同配成帶電荷的聚電解質溶液（Ⅰ型膠原和殼聚糖帶正電荷，透明質酸和多聚谷氨酸負電荷），通過層層自組裝技術將上述聚電解質兩兩配比組裝到純鈦基底面上，共得到4種不同的涂層并進行表征。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)與純鈦基底面相比，涂層的表面形貌發(fā)生了改變，也是布滿了各種不同大小的納米級別的顆粒；AFM檢測

3、結果也證實了相同的變化趨勢。X射線光電子能譜儀分析發(fā)現(xiàn)涂層表面元素成分氮的含量隨著組裝層數的增加而不斷升高；而石英晶體微量天平檢測的涂層厚度也在隨著組裝層數的增加而不斷增厚；最后，接觸角實驗顯示涂層表面的可濕性隨著鈦片表面聚電解質組裝層數的變化而不斷變化。以上結果證明我們所選擇的有機質大分子被成功的組裝到了純鈦表面。接著，在各種涂層上體外培養(yǎng)成骨前體細胞(MC3T3-E1)，觀察細胞的粘附、增殖和分化情況。結果我們發(fā)現(xiàn)以Ⅰ型膠原和透明質

4、酸為骨架的涂層最有利于成骨前體細胞的生長。
　　 接下來，我們設計合成了GRGDSPC多肽序列，并將該多肽序列引入到透明質酸結構中，然后利用自組裝的方法構建了膠原/透明質酸聚電解質復合層。由于該多肽序列中端基為半胱氨酸殘基，該殘基中有活潑的巰基，而巰基之間可以在溫和的條件下進行交聯(lián)形成雙硫鍵，從而使得最后的膠原/透明質酸聚電解質復合膜穩(wěn)定。這樣，我們在引入RGD序列的同時，亦實現(xiàn)了聚電復合膜的交聯(lián)。體外降解研究顯示，該交聯(lián)的膠原

5、/透明質酸復合膜穩(wěn)定性顯著提高；不僅如此，該涂層對谷胱甘肽具有降解響應性，在谷胱甘肽模擬體液中的降解速度大大提高，暗示這種涂層可以在體內通過谷胱甘肽而加速降解。體外生物學評價顯示：與膠原/透明質酸涂層相比，引入RGD的涂層顯著不僅促進了成骨前體細胞的粘附，而且也促進了成骨前體細胞的增殖、分化和鈣化。
　　 在此基礎上，我們計劃在種植體表面的涂層中引入活性生長因子。BMP-2分子由于具有強烈的骨誘導性而備受關注，本實驗也選擇BMP

6、-2作為研究對象。首先將BMP-2溶入膠原溶液而帶上正電荷，接著通過LBL技術將BMP-2引入到涂層中，接下來同樣將涂層交聯(lián)。體外降解實驗表明，該涂層在增加穩(wěn)定性的同時也實現(xiàn)了對BMP-2分子的緩釋作用，而釋放出來的BMP-2分子也沒有喪失原有的活性。生物學評價結果也表明，與RGD功能化的膠原/透明質酸復合膜相比，該活性涂層顯著促進了細胞的分化和功能表達。與細胞外基質的結構功能類似，該涂層不僅僅是作為成骨細胞的支架讓其黏附生長，而且涂層

7、中的RGD序列與緩釋出來的生長因子能夠通過與整合素或其它特定的細胞表面受體與成骨細胞直接或間接的作用，從而促進成骨細胞的生長、遷移和分化，因而具有明顯的仿生特征。
　　 不僅如此，當以同樣的策略在已經引入RGD的膠原/透明質酸復合膜中組裝bFGF分子（最近的研究發(fā)現(xiàn)bFGF不僅能刺激血管的再生，也能明顯促進成骨），也取得了成功，同樣使涂層穩(wěn)定性大大提高，也具有對bFGF分子的緩釋功能。同樣較RGD功能化的膠原/透明質酸復合膜促進

8、了成骨細胞的分化和鈣化，該活性涂層也具有仿生的特點。
　　 最后，我們在涂層中同時組裝上BMP-2和bFGF分子，降解結果顯示該涂層實現(xiàn)了對BMP-2和bFGF分子的緩釋作用，而且BMP-2和bFGF它們之間能獨立釋放，互不干擾。生物學評價結果顯示，組裝了多個生長因子的活性涂層與分別組裝BMP-2或bFGF或RGD功能化的涂層相比較，該涂層顯著促進了成骨細胞的黏附增殖和分化，而且BMP-2和bFGF分子之間具有明顯的協(xié)同作用。這