RNAi沉默ADAMs家族基因對腫瘤細胞生物學活性的影響.pdf

1、華中科技大學碩士學位論文RNAi沉默ADAMs家族基因對腫瘤細胞生物學活性的影響姓名：豐菁申請學位級別：碩士專業(yè)：醫(yī)學遺傳學指導教師：唐艷平20090501華中科技大學碩士學位論文5shRNA）對N2a細胞中目的基因的沉默效應，即是否能抑制靶基因在哺乳動物腫瘤細胞中目的基因的表達，為進一步利用RNA干擾技術對抗腫瘤的基因治療提供新的依據和手段。方法方法：利用DNA重組技術針對ADAM10和PC7基因的shRNA序列克隆到pGensil1

2、中，構建shRNA真核表達載體，通過酶切和測序等方法進行鑒定。用脂質體介導法將已構建好的重組干擾質粒轉染入小鼠神經母細胞瘤N2a細胞株，免疫熒光檢測轉染效率，采用半定量RTPCR和Western免疫印跡法分別從mRNA和蛋白質水平檢測轉染前后目的基因的表達，以及小鼠腦內注射重組干擾質粒pGensil1PC7后，在體觀察局部轉染后綠色熒光的表達，以了解RNA干擾效果。結果結果：成功構建了真核干擾載體pGensil1ADAM10，pGens

3、il1PC7；免疫熒光結果顯示外源性干擾質粒在神經母細胞瘤N2a細胞中獲得瞬時表達，基因轉染和表達率可達90%；兩目的基因mRNA相對水平（與內參的灰度比值）：空白對照組分別為1.350.09、1.390.05，陰性對照轉染組分別為1.250.07、1.270.08，shRNA重組質粒轉染組分別為0.350.03、0.620.05，可見shRNA重組質粒轉染組較其他兩組明顯降低（P0.01）。細胞中目的基因的蛋白水平變化趨勢與mRNA表

4、達相似?；叶葤呙杵毓鈾z測顯示實驗組重組干擾質粒成功轉染入小鼠體內有較強綠色熒光的表達，與對照組具有顯著差異性。結論結論：我們構建的shRNA干擾載體能有效沉默小鼠N2a細胞中靶基因的轉錄和表達，從而可能抑制腫瘤細胞的增殖促其凋亡，為下一步在動物體內利用重組干擾質粒沉默目的基因的表達提供實驗基礎。關鍵詞關鍵詞：短發(fā)夾狀RNA；ADAM10；N2a細胞株；基因干擾綜上所述，研究證實應用短發(fā)夾狀RNA介導的干擾技術對腫瘤細胞可以取得明顯干涉效