簡(jiǎn)介：＼793181四川碩士學(xué)學(xué)校代碼10610學(xué)號(hào)S021987大學(xué)位論文作專二OO五年四月二十日四JIL大學(xué)碩士學(xué)位論文強(qiáng)迫癥認(rèn)知功能的家系研究碩士研究生；李斌導(dǎo)師楊彥春教授中文摘要研究目的①通過(guò)對(duì)強(qiáng)迫癥患者及其一級(jí)親屬進(jìn)行認(rèn)知功能測(cè)評(píng)，探討強(qiáng)迫癥患者及其一級(jí)親屬在智力、記憶、注意及執(zhí)行功能方面的特征是否存在認(rèn)知功能缺陷；②通過(guò)對(duì)強(qiáng)迫癥患者、一級(jí)親屬及正常對(duì)照認(rèn)知功能比較，探討強(qiáng)迫癥認(rèn)知功能損害是否具有家族聚集性，是否可以作為強(qiáng)迫癥遺傳易感基因的“內(nèi)表型”，為強(qiáng)迫癥的遺傳病因?qū)W提供神經(jīng)心理學(xué)依據(jù)。研究方法對(duì)40例首發(fā)或未服藥強(qiáng)迫癥患者、48例一級(jí)親屬分別與40例患者對(duì)照和47鍘親屬對(duì)照采用神經(jīng)心理學(xué)測(cè)驗(yàn)包括知識(shí)、算術(shù)、數(shù)字符號(hào)、木塊拼圖、邏輯記憶、視覺(jué)記憶、S訂OOP測(cè)驗(yàn)、連線測(cè)驗(yàn)、言語(yǔ)流暢性測(cè)驗(yàn)、漢諾塔和威斯康星卡片分類{曰4驗(yàn)修訂版進(jìn)行神經(jīng)認(rèn)知功能評(píng)定；采用YBOCS、HA仍和HAMA對(duì)強(qiáng)迫癥患者進(jìn)行臨床表現(xiàn)和嚴(yán)重程度評(píng)定。結(jié)果1強(qiáng)追癥患者存在記憶、注意和執(zhí)行功能方面的認(rèn)知損害，強(qiáng)迫癥患者在即刻邏輯記憶P0．01、延遲邏輯記憶PO．01、即刻視覺(jué)記憶P0．01、延遲視覺(jué)記憶PO．01、STROOP．C糾正數(shù)P0．01、劃痕測(cè)驗(yàn)B時(shí)間P0．05、漢諾塔計(jì)劃時(shí)間PO．05和執(zhí)行時(shí)NP0_01

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多攜帶大鼠Foxp3基因慢病毒載體的構(gòu)建及慢病毒包裝的研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡(jiǎn)介：目的通過(guò)臨床試驗(yàn)研究，評(píng)價(jià)益艾康膠囊治療艾滋病患者HIVAIDS的客觀效果，并通過(guò)改善患者臨床癥狀和體征，提高CD4和CD4CD8比值，減少各種機(jī)會(huì)性感染的發(fā)生率，提高生活質(zhì)量，進(jìn)一步驗(yàn)證或揭示中醫(yī)藥的作用機(jī)制和科學(xué)內(nèi)涵。方法病例取自河南駐馬店汝南縣農(nóng)村地區(qū)。選擇HIVAIDS80例，所有HIV感染者均被河南疾控中心確診，感染途徑均為19901995年之間的有償獻(xiàn)血感染。我們對(duì)病例按11隨機(jī)分為兩組。將符合納入標(biāo)準(zhǔn)的HIVAIDS患者，隨機(jī)分為治療組及對(duì)照組，治療組給予益艾康膠囊聯(lián)合高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒HAART治療，對(duì)照組單純給予HAART治療，觀察周期為12個(gè)月。觀察治療前后患者CD3T，CD4T，CD8T，CD4CD8比值，卡氏積分，病毒載量。于實(shí)驗(yàn)結(jié)束后采用SAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果經(jīng)過(guò)12個(gè)月的治療，結(jié)果如下①在改善中醫(yī)證候方面，益艾康膠囊聯(lián)合HAART組總有效率7105，單純HAART組總有效率4473，益艾康膠囊在改善患者中醫(yī)證候方面發(fā)揮重要作用。②中醫(yī)證候積分方面，益艾康膠囊聯(lián)合HAART組中醫(yī)證候積分下降較明顯，而單純HAART組中醫(yī)證候積分改善不明顯。③體重方面，益艾康膠囊聯(lián)合HAART組治療前后體重增加較單純HAART組治療前后體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。④卡氏積分變化兩組均可改善患者卡式積分，但益艾康膠囊聯(lián)合HAART效果要優(yōu)于單純HAART治療組。⑤CD3T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)組間比較治療前兩組無(wú)差異。而組內(nèi)比較益艾康膠囊聯(lián)合HAART組治療前后CD3T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而單純HAART治療組治療前后無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑥CD4T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)益艾康膠囊聯(lián)合HAART組能顯著提高CD4T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)。⑦CD8T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)益艾康膠囊聯(lián)合HAART組能顯著提高CD8T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)。⑧CD4CD8比值益艾康膠囊聯(lián)合HAART組能顯著提高CD4CD8比值。⑨病毒載量變化治療前后益艾康膠囊聯(lián)合HAART組和單純HAART組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑩益艾康膠囊具備良好的安全性。結(jié)論根據(jù)研究結(jié)果提示益艾康膠囊主要通過(guò)改善癥狀和體征，提高CD4T數(shù)量及CD4CD8比值，降低CD8T淋巴細(xì)胞數(shù)量，卡氏積分明顯，大大改善了病人的生活質(zhì)量。因此，可以看出在益艾康膠囊在改善患者的生活質(zhì)量方面發(fā)揮著重要作用。益艾康膠囊聯(lián)合抗病毒治療可以延緩艾滋病患者的進(jìn)程，提高患者生存質(zhì)量，延長(zhǎng)其生存期。

簡(jiǎn)介：目的構(gòu)建人單純皰疹病毒1型HERPESSIMPLEXVIRUSHSV1綠色熒光蛋白GREENFLUESCENTPROTEINGFP真核表達(dá)系統(tǒng)用于HSV感染的快速診斷方法提取HSV1DNA利用DNASTAR軟件設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)于HSV1SM44株ICP6啟動(dòng)子的PCR引物引入BAMHI和HINDⅢ酶切位點(diǎn)PCR擴(kuò)增目的基因片段將回收純化的PCR產(chǎn)物連接至PMD18T載體構(gòu)建亞克隆切下目的基因連接至真核表達(dá)載體PEGFP1構(gòu)建重組質(zhì)粒PICP6EGFP經(jīng)雙酶切和DNA測(cè)序鑒定后以陽(yáng)離子脂質(zhì)體法LIPOFECTAMINE2000轉(zhuǎn)染VERO細(xì)胞轉(zhuǎn)染48H后加入G418400ΜGML篩選陽(yáng)性細(xì)胞克隆進(jìn)行放大培養(yǎng)建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株VEROICP6EGFP細(xì)胞以不同量的HSV1感染VEROICP6EGFP細(xì)胞分別于感染后6H、8H、10H以倒置熒光顯微鏡檢測(cè)GFP熒光于感染后15H以流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定GFP熒光的量和強(qiáng)度同時(shí)以人巨細(xì)胞病毒和柯薩奇病毒檢測(cè)VEROICP6EGFP細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)的特異性結(jié)果經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得441BP大小的目的基因片段構(gòu)建的重組質(zhì)粒PICP6EGFP經(jīng)雙酶切及DNA測(cè)序鑒定表明重組正確重組質(zhì)粒PICP6EGFP轉(zhuǎn)染VERO細(xì)胞后以G418篩選11天出現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞克隆建立的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株VEROICP6EGFP細(xì)胞經(jīng)HSV1誘導(dǎo)感染最早于6H即可在倒置熒光顯微鏡下檢測(cè)到GFP綠色熒光隨著時(shí)間的增加GFP熒光的量及強(qiáng)度逐漸增加流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明GFP熒光的量及強(qiáng)度隨HSV1病毒的滴度增加而增加人巨細(xì)胞病毒和柯薩奇病毒感染VEROICP6EGFP細(xì)胞后6H、10H及24H均未檢測(cè)到特異性熒光出現(xiàn)結(jié)論該研究建立的人單純皰疹病毒1型綠色熒光蛋白真核表達(dá)系統(tǒng)具有早期、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)特異性較高進(jìn)一步完善后有望用于HSV1感染的診斷以及抗病毒藥物的篩選

簡(jiǎn)介：背景和目的丙型肝炎病毒核酸HCVRNA檢測(cè)缺乏統(tǒng)一的定量標(biāo)準(zhǔn)，給臨床的診斷和治療帶來(lái)了很多問(wèn)題。研制國(guó)內(nèi)用于HCVRNA擴(kuò)增檢測(cè)的血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，推進(jìn)核酸檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化。構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)內(nèi)含丙型肝炎病毒部分RNA序列的病毒樣顆粒，該病毒樣顆粒所含的HCV部分核酸序列因被噬菌體衣殼蛋白包裹而具有耐核糖核酸酶RNASE特性。替代凍干血清的標(biāo)準(zhǔn)品，使其具有更好的臨床適用性。方法1、選擇HCV陽(yáng)性血漿，用熒光定量PCR檢測(cè)試劑進(jìn)行初步檢測(cè)，再用陰性的獻(xiàn)血員血漿，除纖維蛋白原纖原后進(jìn)行稀釋。采用國(guó)際公認(rèn)的PCR內(nèi)標(biāo)定量方法，即ROCHE公司COBASAMPLIC及相應(yīng)試劑進(jìn)行檢測(cè)，以WHO標(biāo)準(zhǔn)品NIBSC編號(hào)96790進(jìn)行比對(duì)定值。2、將該定值制備物發(fā)放給HCVRNA熒光定量試劑的生產(chǎn)廠家進(jìn)行檢測(cè)。3、由于HCV分型和HCVRNA定量檢測(cè)試劑盒，所檢測(cè)的區(qū)域主要集中在5UTR區(qū)，因此本研究擬選用5UTR區(qū)作為MS2噬菌體的包裝序列。引物5端引入HINDⅢ酶切位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行T載體克隆后用限制性內(nèi)切酶HINDⅢ酶切獲得所需要的目的片段，與用HINDⅢ酶切的表達(dá)載體PNCCL1相連接，構(gòu)建一新的表達(dá)載體PNCCL1HCV。在IPTG誘導(dǎo)下，衣殼蛋白會(huì)在攜帶有PETMS2HCV的細(xì)菌中表達(dá)，并與RERNA組裝成病毒樣顆粒。誘導(dǎo)后的細(xì)菌經(jīng)超聲碎菌，離心后即可得到含病毒樣顆粒的上清。為驗(yàn)證包裝的核酸為HCVRERNA，取20ΜL上清按1∶10至1∶106比例稀釋后，依照異硫氰酸胍鹽提取RNA的方法提取VLPS的RNA，然后進(jìn)行RTPCR。取20ΜL所得到的上清，加入RNASEA100U和DNASEI20U，37℃溫育4天以觀察病毒樣顆粒的穩(wěn)定性。將病毒樣顆粒用PEG6000沉淀后，加入正常人陰性血清，取20ΜL于45℃放置3天觀察病毒樣顆粒是否適合運(yùn)輸。結(jié)論第一部分研究獲得的定值凍干血清是我國(guó)第一個(gè)用于核酸檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品。由于該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)基質(zhì)為凍干血清，含有完整的病毒核酸序列，與臨床檢測(cè)的病人標(biāo)本一致，具有很好的臨床適用性。推廣范圍包括各個(gè)HCVRNA檢測(cè)試劑生產(chǎn)廠家、醫(yī)院臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室及進(jìn)行核酸篩查的血站等。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，在國(guó)內(nèi)主要PCR檢測(cè)試劑的生產(chǎn)廠家均得到了應(yīng)用，在穩(wěn)定性及定值的準(zhǔn)確性方面得到了充分肯定。由該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)傳遞的血清基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，由于血清基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線同待測(cè)樣本一樣經(jīng)過(guò)純化和逆轉(zhuǎn)錄步驟，消除了標(biāo)準(zhǔn)品與樣本間提取效率和逆轉(zhuǎn)錄效率檢測(cè)差異，同時(shí)消除了不同試劑不同人員操作間的差異，又具有溯源性，使檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確并具有可比性，因此該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在臨床基因擴(kuò)增定量檢測(cè)HCVRNA方面有廣闊的應(yīng)用前景，將有力的促進(jìn)臨床HBVDNA和HCVRNA定量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化。第二部分研究得到的表達(dá)載體PETMS2HCV及原核表達(dá)系統(tǒng)，可以作為構(gòu)建和制備耐RNASE的HCVRNA標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品的平臺(tái)。獲得了HCV1B、2A、6A型三種基因型病毒樣顆粒。該病毒樣顆粒可以直接作為作為凍干血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的替代品，也可以做HCV核酸測(cè)定中的陽(yáng)性質(zhì)控物和某些HIVRNA外標(biāo)定量測(cè)定的外標(biāo)定量標(biāo)準(zhǔn)；還可以為HCVRTPCR檢測(cè)試劑盒和實(shí)驗(yàn)室室問(wèn)質(zhì)量評(píng)價(jià)提供無(wú)生物傳染危險(xiǎn)性的樣本。如果對(duì)PETMS2HCV中的HCV檢測(cè)的目的片段進(jìn)行缺失、插入和突變等修飾，所獲得的病毒樣顆?？梢宰鳛镠CV定量測(cè)定中的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)和HCVRTPCR測(cè)定的內(nèi)標(biāo)質(zhì)控物。

簡(jiǎn)介：VIF（VIRALINFECTIVITYFACT）是HIV1自身編碼的附屬蛋白之一，在HIV1復(fù)制過(guò)程中起著重要作用。最近，對(duì)VIF的研究揭示了固有免疫的新成員APOBEC3G、APOBEC3F，是一種抑制HIV1感染的細(xì)胞內(nèi)蛋白，也是一種胞苷脫氨酶，在病毒復(fù)制末期被整合進(jìn)子代病毒粒子，繼而引發(fā)逆轉(zhuǎn)錄病毒CDNA負(fù)鏈產(chǎn)生大量的DCDU突變，能致死性突變反轉(zhuǎn)錄病毒和反轉(zhuǎn)錄元件。研究發(fā)現(xiàn)，APOBEC3G和APOBEC3F為APOBEC家族成員，位于人類染色體22Q12Q13，二者均能介導(dǎo)固有免疫，對(duì)病毒尤其是對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒具廣譜抗病毒效應(yīng)，其中，APOBEC3G對(duì)HBV具有強(qiáng)烈的抑制作用，國(guó)外腫瘤實(shí)驗(yàn)表明，APOBEC3G抑制MLV效果顯著，抑制HBV復(fù)制明顯優(yōu)于抗病毒藥物3TC，并可使對(duì)照中的HBVDNA至少下降50倍。與APOBEC3G一樣，APOBEC3F也具有DNA編輯功能，可與APOBEC3G共表達(dá)，一起抵抗病毒侵入。新近研究發(fā)現(xiàn)，APOBEC3G和APOBEC3F為人體細(xì)胞表達(dá)的兩種胞苷脫氨酶，二者對(duì)病毒表達(dá)的VIF均存在重要拮抗關(guān)系。VIF是HIV自身基因組VIF基因表達(dá)的一種重要病毒感染因子，與病毒感染密切相關(guān)。機(jī)體APOBEC3G和APOBEC3F過(guò)量表達(dá)，可有效抵抗病毒VIF的功能行使，此一現(xiàn)象對(duì)VIF缺陷株病毒（VIF）失去感染性尤為顯著。APOBEC3G、APOBEC3F與HIV病毒VIF之間存在的這一拮抗關(guān)系為艾滋?。ˋCQUIREDIMMUNEDEFICIENCYSYNDROME，AIDS）治療帶來(lái)了新的希望和曙光。以APOBEC3G和APOBEC3F作新藥靶點(diǎn)，研究開(kāi)發(fā)相關(guān)蛋白藥物或生物制劑，對(duì)于艾滋病及其它逆轉(zhuǎn)錄病毒病防治無(wú)疑具有非常重要的意義。目前，從生物信息學(xué)角度研究分析APOBEC3G和APOBEC3F基因的文獻(xiàn)不多，國(guó)內(nèi)除王翌等對(duì)APOBEC3G基因曾作過(guò)一些粗略分析外，APOBEC3F基因研究文獻(xiàn)鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究在開(kāi)展對(duì)APOBEC3F基因生物信息學(xué)研究的同時(shí)，結(jié)合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)嘗試APOBEC3G基因提取和分析，以期從生物信息學(xué)和分子生物學(xué)角度揭示和闡述APOBEC3G、APOBEC3F與病毒VIF之間的相互作用關(guān)系。在APOBEC3F基因生物信息學(xué)分析中，作者在基因水平分析了APOBEC3F基因特性；在蛋白質(zhì)水平對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)、卷曲螺旋以及細(xì)胞定位等進(jìn)行了預(yù)測(cè)；運(yùn)用基因庫(kù)大量EST序列，通過(guò)電子克隆獲得了豬APOBEC3F的全基因序列，并進(jìn)行了相關(guān)分析。

簡(jiǎn)介：乙型肝炎病毒HEPATITISBVIRUS，HBV是一種部分雙鏈環(huán)狀嗜肝DNA病毒，宿主范圍狹窄，主要是靈長(zhǎng)類中的人類和大猩猩。HBV在人類可引起急、慢性乙型肝炎、肝纖維化、并與原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。Α干擾素LNTERFERONΑ，IFNΑ仍是目前最常用的治療乙型肝炎病毒感染的藥物。它通過(guò)建立細(xì)胞內(nèi)抗病毒狀態(tài)和免疫調(diào)節(jié)作用抑制并清除病毒。但臨床發(fā)現(xiàn)約23的患者表現(xiàn)為對(duì)Α干擾素治療無(wú)反應(yīng)，即沒(méi)有出現(xiàn)HBEAG血清轉(zhuǎn)換和血清HBVDNA水平降低，除了宿主因素外還與病毒本身抗干擾素作用有關(guān)。目前比較明確的是HBVDNA聚合酶的抗干擾素作用。FOSTER等發(fā)現(xiàn)，表達(dá)HBVDNA聚合酶末端蛋白可顯著抑制細(xì)胞對(duì)Α干擾素反應(yīng)，并認(rèn)為是由于TP表達(dá)阻斷Α干擾素通路引起，但其抗IFNΑ作用的功能區(qū)域迄今尚不清楚。中國(guó)地區(qū)HBV感染主要為B基因型及C基因型，臨床資料顯示，B基因型HBV感染對(duì)干擾素治療的反應(yīng)好于C基因型，我們通過(guò)對(duì)大樣本HBVDNA聚合酶區(qū)氨基酸序列分析后發(fā)現(xiàn)，B、C基因型HBVDNA聚合酶在TP區(qū)及SPACER區(qū)分別存在14及44個(gè)氨基酸差異，目前尚不清楚這些氨基酸差異是否與B、C基因型HBV感染對(duì)干擾素治療反應(yīng)差異有關(guān)。另TP位于DNA聚合酶的氨基端，通常情況下只能以DNA聚合酶的形式出現(xiàn)，并不存在單獨(dú)游離的TP。但隨著擴(kuò)增HBV全基因組DNA方法的建立，在乙肝患者中分離到多種HBV基因組剪接變異體、缺失突變體。其中在2309NT以后發(fā)生剪接和缺失的HBV亞基因組DNA能編碼TP相關(guān)蛋白HBVDNA聚合酶的編碼區(qū)起始于2309NT。對(duì)于這些剪接和缺失的HBV亞基因組DNA及其編碼的各種TP相關(guān)蛋白的抗干擾素作用還未有過(guò)系統(tǒng)研究。為此，本研究?jī)?nèi)容包括三部分一乙型肝炎病毒TPSPACER抗干擾素作用功能區(qū)域分析以HBV全基因組DNA重組質(zhì)粒FMU013為模板，PCR擴(kuò)增獲得DNA聚合酶TPSPACER區(qū)各功能區(qū)基因片段，克隆到真核表達(dá)載體PCDNA31HISC中，構(gòu)建各功能區(qū)缺失突變體，與干擾素反應(yīng)報(bào)告質(zhì)粒P616CAT共轉(zhuǎn)染HUH7肝細(xì)胞，檢測(cè)干擾素處理后CAT表達(dá)改變，確定抗IFNΑ反應(yīng)的功能區(qū)域。二比較B、C基因型TP相關(guān)蛋白抗干擾素作用的強(qiáng)弱收集干擾素治療有反應(yīng)、無(wú)反應(yīng)慢性乙型肝炎患者治療前血清，抽提血清DNA，以限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法確定基因型。PCR獲得各B、C基因型標(biāo)本TPSPACER區(qū)N端257AA基因片段，克隆到真核表達(dá)載體PCDNA31HISC中。各重組表達(dá)載體與干擾素反應(yīng)報(bào)告質(zhì)粒P616CAT共轉(zhuǎn)染HUH7肝細(xì)胞，檢測(cè)干擾素處理后CAT表達(dá)改變，比較B、C基因型TPSPACER區(qū)抗干擾素作用差別三乙型肝炎病毒剪接變異缺失突變體編碼的TP相關(guān)蛋白抗干擾素作用收集中、重度慢性乙型肝炎患者血清，抽提血清DNA，PCR擴(kuò)增HBV基因組DNA克隆到PUC18載體中并測(cè)序。與標(biāo)準(zhǔn)株HBV序列進(jìn)行相似性比較，分析其結(jié)構(gòu)，找出符合本研究的所有可能存在的剪接變異類型在2309NT以后發(fā)生剪接和各種缺失突變體在2309NT以后發(fā)生缺失，克隆各剪接變異體和缺失突變所編碼的TP相關(guān)蛋白基因到真核表達(dá)載體PCDNA31HISC中，各TP相關(guān)蛋白基因重組載體與干擾素反應(yīng)報(bào)告質(zhì)粒P616CAT共轉(zhuǎn)染HUH7肝細(xì)胞，檢測(cè)干擾素處理后CAT表達(dá)改變，確定各TP相關(guān)蛋白抗干擾素作用并分析其發(fā)揮抗干擾素作用的功能區(qū)域。本研究確定了TP相關(guān)蛋白抗干擾素作用的功能區(qū)域與SPACER區(qū)密切相關(guān)，且其發(fā)揮作用需要完整的TP區(qū)；B基因型HBV感染對(duì)干擾素治療的反應(yīng)性顯著好于C基因型HBV感染，但這種差異與HBVTPSPACER區(qū)抗干擾素作用無(wú)關(guān)。分離獲得了8種剪接變異體、5種缺失突變體，證實(shí)其編碼的兩種TP相關(guān)蛋白具有抗干擾素作用，TPSPACER是其發(fā)揮作用的功能區(qū)。

簡(jiǎn)介：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人申明所呈交的學(xué)位論文是我本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的研究成果，也不包含為獲得我?；蚱渌逃龣C(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料，與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示謝意。申請(qǐng)學(xué)位論文與資料若有不實(shí)之處，本人承擔(dān)一切相關(guān)責(zé)任。論文作者簽名壟重至釜日期翌二￡二至L中國(guó)醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本人完全了解中國(guó)醫(yī)科大學(xué)有關(guān)保護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的規(guī)定，即研究生在攻讀學(xué)位期間論文工作的知識(shí)產(chǎn)權(quán)單位屬中國(guó)醫(yī)科大學(xué)。本人保證畢業(yè)離校后，發(fā)表論文或使用論文工作成果時(shí)署名單位為中國(guó)醫(yī)科大學(xué)，且導(dǎo)師為通訊作者，通訊作者單位亦署名為中國(guó)醫(yī)科大學(xué)。學(xué)校有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。學(xué)?？梢怨紝W(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容保密內(nèi)容除外，以采用影印、縮印或其他手段保存論文。論文作者簽名指導(dǎo)教師簽名日期中文論著摘要腺病毒介導(dǎo)的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子二步轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)系統(tǒng)HTERTP．TSTA在卵巢癌中轉(zhuǎn)錄活性的研究研究背景卵巢上皮細(xì)胞癌目前仍是嚴(yán)重威脅廣大婦女健康的惡性腫瘤。尋求傳統(tǒng)手術(shù)、放化療之外的新的療法十分必要。在卵巢癌的生物治療中，基因治療備受矚目。已有愈來(lái)愈多的轉(zhuǎn)基因治療進(jìn)入臨床研究。為了防止促凋亡基因?qū)φ＜?xì)胞的毒性作用，實(shí)現(xiàn)治療基因在腫瘤組織中的靶向表達(dá)十分必要。應(yīng)用腫瘤特異性啟動(dòng)子TUMORSPECIFICPROMOTER,TSP對(duì)治療基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，再通過(guò)對(duì)病毒包膜基因進(jìn)行修飾，改變病毒對(duì)細(xì)胞的CAR嗜性為整合素嗜性，來(lái)提高病毒對(duì)卵巢癌細(xì)胞的感染水平，是行之有效的方法之一。研究目的檢測(cè)HTERT啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)系統(tǒng)TSTA．HTERTP在卵巢癌細(xì)胞及正常細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性。、研究方法應(yīng)用AD．MAX系統(tǒng)將各重組腺病毒載體包裝成重組腺病毒并鑒定、純化及擴(kuò)增。應(yīng)用熒光顯微鏡檢測(cè)各啟動(dòng)子系統(tǒng)調(diào)控下表達(dá)EGFP的重組腺病毒感染卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3、H08910，SKOV3，宮頸癌細(xì)胞系HELA及正常人臍血內(nèi)皮細(xì)胞系ECV304后EGFP的表達(dá)情況，應(yīng)用CCK．8試劑可簡(jiǎn)便而準(zhǔn)確的進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析，并應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的熒光激活細(xì)胞分類器FLUORESCENCEACTIVATEDCELLSORTER,FACS對(duì)感染的不同細(xì)胞進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，檢測(cè)細(xì)胞的發(fā)光強(qiáng)度。研究結(jié)果1、載體構(gòu)建與病毒制備成功制備RGD修飾型腺病毒載體CTD010．1及

簡(jiǎn)介：A型流感病毒屬于正粘病毒科單股負(fù)鏈的RNA病毒。由于其宿主廣泛、傳染性強(qiáng)、傳播速度快短時(shí)間內(nèi)可造成局部地區(qū)的爆發(fā)或全球范圍的流行。自19世紀(jì)以來(lái)已爆發(fā)四次全球性的流感大流行其中1918年爆發(fā)的“西班牙流感H1N1”大流行最為嚴(yán)重造成全世界近5000萬(wàn)人死亡給人類健康和全球經(jīng)濟(jì)帶來(lái)了極大的危害。目前針對(duì)A型流感病毒感染的預(yù)防和治療措施主要是采用離子通道阻斷劑和神經(jīng)氨酸酶抑制劑等抗病毒藥物但是這些藥物對(duì)于人體神經(jīng)系統(tǒng)均有一定的副作用而且由于A型流感病毒基因變異快隨著藥物的大量使用極易產(chǎn)生耐藥性毒株。因此進(jìn)行流感病毒治療藥物及抗病毒靶標(biāo)研究迫在眉睫。微小RNAMIRNA是長(zhǎng)度約22NT的非編碼單鏈小RNA分子廣泛存在于真核生物基因組中其基因位置及序列都十分保守。MIRNA主要通過(guò)互補(bǔ)結(jié)合到靶標(biāo)MRNA上而起到轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控的作用參與許多細(xì)胞過(guò)程包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡和腫瘤形成等。目前已有研究表明宿主MIRNA在乙肝病毒、丙肝病毒及人類免疫缺陷病毒等多種病毒感染中通過(guò)對(duì)宿主或病毒的基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控從而影響病毒復(fù)制、侵染及致病等過(guò)程。此外由于MIRNA的作用途徑專一且效果明顯MIRNA及其靶點(diǎn)已成為治療病毒性疾病特效基因藥物的研究熱點(diǎn)。A型流感病毒基因組由8個(gè)節(jié)段組成前三個(gè)節(jié)段編碼聚合酶蛋白PB2、PB1和PA三者共同組成RNA依賴的RNA聚合酶蛋白復(fù)合體。第五個(gè)節(jié)段編碼核蛋白NP包裹著病毒的核酸起保護(hù)作用。在流感病毒復(fù)制過(guò)程中NP、病毒RNA及三個(gè)聚合酶蛋白共同組成核糖核蛋白復(fù)合體RNPS不僅參與病毒基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯還在病毒RNA及蛋白的入核、出核及胞質(zhì)聚集過(guò)程中發(fā)揮著重要的功能。這四個(gè)基因節(jié)段不僅功能重要而且存在很多保守位點(diǎn)因此針對(duì)以上基因?qū)ふ倚碌乃幬锇形谎兄品€(wěn)定的抗流感病毒藥物具有舉足輕重的作用。本研究以流感病毒聚合酶蛋白基因和核蛋白基因?yàn)榘悬c(diǎn)尋找廣譜調(diào)控A型流感病毒復(fù)制的宿主MIRNA并確定MIRNA的靶位點(diǎn)為宿主抗病毒防御機(jī)制提供更深層次的理解也為應(yīng)用生物信息學(xué)方法來(lái)開(kāi)發(fā)廣譜抗流感病毒的基因藥物及尋找新抗病毒靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。本研究首先利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)并篩選廣譜靶向A型流感病毒復(fù)制相關(guān)基因的宿主MIRNA。我們以MIRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)軟件MIRA為主體設(shè)計(jì)了廣譜靶向A型流感病毒基因的宿主MIRNA的預(yù)測(cè)篩選流程。采用PERL語(yǔ)言編程從MIRA軟件輸出結(jié)果中提取有用信息并通過(guò)設(shè)定嚴(yán)格的軟件參數(shù)制定詳盡的篩選原則使篩選出的MIRNA兼具廣譜靶向率高與抑制病毒復(fù)制效果好等優(yōu)點(diǎn)。針對(duì)PB2基因挑選了MIR1883P和MIR345針對(duì)PB1基因挑選了MIR3183針對(duì)PA基因挑選了MIR15A和MIR99B針對(duì)NP基因挑選了MIR7693P篩選的6個(gè)MIRNA對(duì)A型流感病毒的廣譜靶向率分別為813％95X7?1D4和953。隨后從季節(jié)性流感病毒AFM147H1N1毒株中擴(kuò)增PB1、PB2、PA及NP基因全長(zhǎng)并構(gòu)入T載體中通過(guò)測(cè)序獲得了該毒株的基因序列MIRA軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示所篩選的6個(gè)MIRNA在該毒株上均具有良好的靶向性堿基對(duì)匹配結(jié)合模式具有代表性可以利用該毒株進(jìn)行MIRNA的功能驗(yàn)證。采用一系列實(shí)驗(yàn)方法逐步驗(yàn)證MIRNA抑制A型流感病毒復(fù)制的效果。1首先采用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)進(jìn)行初步篩選根據(jù)MIRNA的熒光抑制率判定MIRNA與潛在靶標(biāo)的結(jié)合能力。結(jié)果顯示生物信息學(xué)篩選出的6條MIRNA與潛在靶標(biāo)均有一定的結(jié)合能力但是靶向于PA基因的MIR15A和MIR99B熒光抑制率較小僅為2882和2075其余4條MIRNA與潛在靶標(biāo)結(jié)合能力較強(qiáng)MIR1883P和MIR345可靶向結(jié)合PB2基因MIR3183可靶向結(jié)合PB1基因三者熒光抑制率均達(dá)到45左右。MIR7693P可靶向結(jié)合NP基因熒光抑制率為365。2進(jìn)一步驗(yàn)證MIRNA對(duì)A型流感病毒蛋白表達(dá)的影響。首先構(gòu)建了表達(dá)PB1、PB2、PA及NP蛋白基因的真核表達(dá)載體并與人工合成的MIRNA模擬物共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。WESTERN印跡結(jié)果顯示4條MIRNA均可顯著抑制相應(yīng)病毒蛋白的表達(dá)。其中MIR7693P對(duì)NP蛋白表達(dá)的抑制效果最為顯著。MIR1883P和MIR345對(duì)PB2蛋白表達(dá)的抑制效果、MIR3183對(duì)PB1蛋白表達(dá)的抑制效果與陽(yáng)性對(duì)照MIRNAMIR491對(duì)靶標(biāo)蛋白PB1蛋白表達(dá)的抑制效果基本一致。3最后觀察MIRNA對(duì)A型流感病毒復(fù)制的抑制效果。首先驗(yàn)證了季節(jié)性流感病毒AFM147H1N1毒株在MDCK細(xì)胞系及A549細(xì)胞系上的復(fù)制動(dòng)力學(xué)特性繪制了一步生長(zhǎng)曲線確定了病毒最佳接毒劑量隨后利用最佳病毒感染劑量進(jìn)行了MIRNA抑制流感病毒復(fù)制實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MIR1883P可顯著抑制A型流感病毒在A549細(xì)胞上的復(fù)制與對(duì)照組相比病毒感染后48H病毒滴度降低08個(gè)TCID50。MIR345效果其次可使病毒感染后48H病毒滴度降低051個(gè)TCID50。二者均優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照MIR491其僅使病毒感染后48H病毒滴度降低043個(gè)TCID50。基于以上研究我們通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)及一系列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證最終篩選到一個(gè)MIRNA即MIR1883P可廣譜靶向結(jié)合A型流感病毒PB2基因抑制PB2蛋白表達(dá)顯著抑制A型流感病毒的復(fù)制。不僅如此我們通過(guò)生物信息學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)MIR1883P對(duì)近期爆發(fā)的人感染H7N9禽流感病毒PB2基因也具有很好的靶向性而且其靶向效果優(yōu)于AFM147H1N1毒株。本研究的成果為宿主抗流感病毒防御機(jī)制提供了更深層次的理解同時(shí)提出了一種廣譜靶向抑制流感病毒的MIRNA篩選方法為應(yīng)用生物信息學(xué)方法來(lái)挖掘抗A型流感病毒的MIRNA基因藥物的研究奠定了理論基礎(chǔ)。

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簡(jiǎn)介：該研究以13例接受IFN治療而應(yīng)答效果不一的慢性丙型肝炎病人為研究對(duì)象分別留取IFN治療前后的血清通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄套式PCR擴(kuò)增HCVNS5A區(qū)并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆克隆后的PCR產(chǎn)物在同一凝膠上進(jìn)行單鏈構(gòu)象多態(tài)性SSCP分析和異質(zhì)性雙鏈HD分析篩選其準(zhǔn)種QUASISPECIES以準(zhǔn)種的多少代表基因的復(fù)雜性對(duì)治療前后的優(yōu)勢(shì)準(zhǔn)種測(cè)序并與HCV1B前基因型HCVJ序列比較結(jié)果顯示HCVNS5A準(zhǔn)種的多少與IFN的應(yīng)答呈負(fù)相關(guān)IFN完全應(yīng)答組和部份應(yīng)答組病人治療前準(zhǔn)種數(shù)明顯少于無(wú)應(yīng)答組P005

簡(jiǎn)介：目的在持續(xù)急性鴨乙型肝炎病毒感染模型的基礎(chǔ)上，觀察中藥復(fù)方茵陳蒿湯對(duì)鴨血清DHBVDNA、DHBSAG的影響，以探索茵陳蒿湯抗肝損傷退黃的療效機(jī)制。方法購(gòu)健康成年武漢麻鴨100只，利用DHBSAGELISA檢測(cè)及DHBVDNA斑點(diǎn)雜交方法選用DHBVDNA、DHBSAG均陰性的武漢麻鴨60只作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分別經(jīng)翼下靜脈注射10ML乙肝病毒強(qiáng)陽(yáng)性血清，7天接種一次，共接種4次，建立穩(wěn)定持續(xù)的乙型肝炎病毒急性感染模型。而后將60只鴨隨機(jī)分為3組，每組20只，每組分別給予茵陳蒿湯、拉米夫定灌胃治療及生理鹽水對(duì)照觀察，共治療30天，觀察用藥前后以及治療組與對(duì)照組的DHBVDNA、DHBSAG的變化情況。結(jié)果對(duì)照組實(shí)驗(yàn)鴨DHBVDNA、DHBSAG30天內(nèi)始終維持陽(yáng)性，并且滴度無(wú)顯著變化。兩治療組DHBVDNA滴度在第15天均有所降低，但下降程度并未達(dá)顯著性意義；30天后兩治療組DHBVDNA滴度與用藥前比較顯著降低P＜005，與對(duì)照組比較亦顯著降低P＜005，其中拉米夫定組DHBVDNA含量的下降比茵陳蒿湯組更為明顯，二者差異有顯著意義P＜005。提示茵陳蒿湯與拉米夫定對(duì)DHBVDNA復(fù)制均有抑制作用，其中拉米夫定的抑制作用強(qiáng)于茵陳蒿湯。用藥30天后茵陳蒿湯組DHBSAG的滴度下降與用藥前相比有顯著差異P＜005，與對(duì)照組也有顯著性差異P＜005；拉米夫定組治療30天后DHBSAG的滴度雖有所下降，但與治療前相比沒(méi)有顯著性差異，與對(duì)照組DHBSAG的滴度相比，差異亦不明顯。提示茵陳蒿湯對(duì)DHBSAG在體內(nèi)的表達(dá)合成具有抑制作用，但拉米夫定對(duì)此則沒(méi)有明顯作用。結(jié)論茵陳蒿湯對(duì)鴨乙肝病毒持續(xù)感染造成的急性損傷不僅具有直接減輕肝損傷的作用，而且對(duì)鴨乙肝病毒還具有直接抑制作用，其作用通過(guò)抑制DHBVDNA的復(fù)制及DHBSAG蛋白的表達(dá)途徑來(lái)達(dá)成。顯然，茵陳蒿湯的作用是多靶位的，綜合性的。

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簡(jiǎn)介：20143SKBR3HER2

簡(jiǎn)介：上海第二醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文人巨細(xì)胞病毒抗原性肽段的固相合成及以其為抗原的ELISA檢測(cè)方法的建立姓名孫立山申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)（免疫學(xué)測(cè)定）指導(dǎo)教師周文達(dá)20050401人巨細(xì)胞病毒抗原性肽段的固相合成及以其為抗原的ELISA檢測(cè)方法的建立中文摘要人巨細(xì)胞病毒抗原性肽段的固相合成及以其為抗原的ELISA檢測(cè)方法的建立中文摘要人巨細(xì)胞病毒HUMANCYTOMEGALOVIRUS，HCMV也稱人皰疹病毒5型HUMANHERPESVIMS5，HHVS屬B皰疹病毒亞科。人巨細(xì)胞病毒在人群中感染非常普遍，但大多數(shù)臨床上呈不顯性感染或潛伏感染，多數(shù)人在兒童或青少年期受HCMV感染后獲得免疫。對(duì)于孕婦，原發(fā)感染或新的HCMV復(fù)發(fā)感染可引起新生兒宮內(nèi)感染或圍生期感染，可致感染患兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累、多器官損害、智力低下或耳聾等；在正常健康人中可引起單核細(xì)胞增多癥；在免疫狀態(tài)低下的人群器官移植受者、艾滋病患者、癌癥患者及放射損傷患者等中，HCMV可引起嚴(yán)重的感染，甚或致死。鑒于HCMV在臨床疾病中的重要作用，已經(jīng)引起醫(yī)學(xué)界的廣泛重視。巨細(xì)胞病毒感染的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)有多種方法，除了病毒的分離，還包括抗體檢測(cè)、抗原檢測(cè)、病毒核酸檢測(cè)DNA、RNA等方法。傳統(tǒng)的人巨細(xì)胞病毒特異性抗體的檢測(cè)多是以病毒裂解物為抗原，此類抗原存在很多缺點(diǎn)①由很多病毒抗原組成，所含抗原表位不確定，很難標(biāo)準(zhǔn)化②需要在成纖維細(xì)胞中進(jìn)行病毒培養(yǎng)，會(huì)導(dǎo)致潛在細(xì)胞蛋白的污染。由于器官移植受者可能會(huì)產(chǎn)生暫時(shí)性自身抗體反應(yīng)，而細(xì)胞蛋白的污染可能會(huì)導(dǎo)致HCMV抗體檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性；③與皰疹病毒科的其它病毒感染所產(chǎn)生的抗體存在交叉反應(yīng)。為了提高HCMV抗體檢測(cè)的敏感度和特異性，本研究根據(jù)HCMV強(qiáng)抗原性表位，擬以固相多肽合成方法合成HCMV抗原性肽段，并以此多肽為抗原建立對(duì)HCMV特異性抗體檢測(cè)的ELISA方法。根據(jù)國(guó)外對(duì)HCMV抗原性表位的研究，我們選擇了病毒蛋白PPL50、GB、PP52、PP28及13965的7個(gè)強(qiáng)抗原性表位。以匿相多肽合成技術(shù)SOLID曲ASCPOLYPEPTIDESYNTHESISSPPS，以FMOCGLYWANG樹(shù)脂為固相載體，以NQFMOC基團(tuán)保護(hù)的氨基酸為原料，以TBTU／HOBT作為偶聯(lián)試劑／活化劑，經(jīng)過(guò)脫保護(hù)洗滌縮合一洗滌循環(huán)的合成的路線，從C端一N端順序依次偶聯(lián)氨基酸，直至合成所需的肽段。然后將多肽從樹(shù)脂上裂解下來(lái)，洗滌，凍干，得到粗肽。所得粗肽再經(jīng)過(guò)離子交換層析和反相高效液相色譜純化，最終得到純度95％的抗原肽。應(yīng)用棋盤滴定實(shí)驗(yàn)確定了抗原肽的最佳包被濃度、最佳包被用緩沖液等最適實(shí)驗(yàn)條件。并以所合成的7段肽分別包被96微孔板，以間接ELISA方法，對(duì)所